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Stra8(stimulated by retinoic acid gene8，Stra8)，是视黄酸(retinoic acid，RA)诱导基因之一，对于减数分裂启动和男性生殖发育具有重要作用。Stra8在正在分化的精原细胞到前细线期精母细胞表达。而且Stra8在细胞核与细胞质均具有定位，并根据发挥功能的不同在核质之间穿梭。Stra8敲除小鼠不育，但其在精子发生中的作用及机制尚未阐明。本课题通过以下两个部分研究Stra8在精子发生中的作用与机制:第一，Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。第二，体外研究Stra8与Setd8的相互作用。该研究为揭示Stra8在精子发生中的作用奠定了基础。 本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 Stra8在精子发生中抑制细胞凋亡机制的初步探索。 （一）通过体内和体外实验，发现并鉴定Stra8在精子发生中具有抑制细胞凋亡的作用。在Stra8KO小鼠模型、维生素A缺乏小鼠(VAD)及VAD恢复小鼠（VAR）中发现Stra8具有抑制凋亡的作用。我们选择11dpp的StraSKO小鼠睾丸进行TUNEL实验并计数凋亡细胞，结果发现:与WT小鼠相比，Stra8KO小鼠生精细胞管内凋亡细胞数量明显增加。其次，构建维生素A缺乏和VAD恢复小鼠模型(VAD and VAR)。通过TUNEL实验发现在45天和61天的VAD小鼠模型中，凋亡细胞明显增加，进一步验证Stra8具有抑制凋亡作用。最后，在Stra8过表达精原细胞验证了Stra8抑制凋亡的作用，应用TUNEL实验和流式细胞术对凋亡细胞进行计数，也发现在Stra8过表达精原细胞内凋亡细胞数量明显减少。 （二）通过基因微阵列分析，探索Stra8抑制细胞凋亡的机制及相关通路。通过基因微阵列分析，我们发现了5个上调基因和4个下调基因与细胞凋亡相关。通过qRT-QCR验证与文献查阅发现，在这些DEGs中，PDK1（AKT重要上游因子）、ANG2（BCL2抑制因子）、USP33、TCF4、GSTP1（MAPK相关因子）、OSGIN1（P53相关因子）和Caspase3与AKT信号通路相关，同时BCL2、P53、ERK(MAPK1/3)、JNK(MAPK8/9)和P38(MAPK14)是AKT信号通路的关键因子。 （三）Stra8在精子发生中抑制凋亡作用的潜在通路绘制。我们进一步在mRNA和蛋白水平检测发现，与对照组相比，Stra8过表达精原细胞内PDK1、AKT、BCL2和ERK的表达水平均明显升高，P53mRNA表达水平显著降低，但其蛋白表达没有明显差别。同时，通过检测发现，与对照组相比，Stra8过表达精原细胞内Caspase3在mRNA和蛋白水平均表达降低。因此，Stra8可能通过AKT通路直接或间接抑制P53或激活BCL2家族基因，与MAPK通路相互作用，进而抑制caspases家族基因，发挥抑制凋亡作用。 第二部分 体外研究Stra8与Setd8的相互作用。 （一）Stra8过表达精原细胞和P19细胞中Stra8、Setd8和H4K20me1的表达。应用WB检测Stra8过表达精原细胞内Setd8和H4K20me1的表达发现，与对照组相比，在Stra8过表达精原细胞中，Set8表达降低，而H4K20me1表达增高，提示三者之间可能具有相互调控关系。之后，我们应用4μM RA诱导P19细胞36-48hr，使其瞬时过表达Stra8，然后检测诱导后P19细胞内Set8和H4K20me1的表达，结果发现，与未诱导P19相比，RA诱导P19细胞分化后，Set8表达水平降低，而H4K20me1表达增高，与在Stra8过表达精原细胞的表型一致，进一步验证三者之间具有相互调控关系。 （二）Stra8过表达细胞株的细胞周期同步化方法的建立。由于Stra8、Setd8和H4K20me1的表达与细胞周期相关。因此我们参照Hela细胞的细胞周期同步化方法，将Stra8过表达精原细胞同步化至细胞周期的不同阶段。首先，应用血清剥夺法同步化Stra8过表达精原细胞至G1期，分别血清剥夺培养细胞24，36，48，60，72，84，96hr，发现血清剥夺培养72hr后，细胞周期同步化至G1期效率最高，达60-70％。其次，应用“二次胸苷(2.5mM)阻滞法”同步化Stra8-GC1至S期，第二次释放时间分别为0，3，6，9hr,发现二次释放时间3hr后细胞的S期同步化效率最好，达60-70％。最后，应用100ng/ml诺考达唑分别处理4，8，12hr，发现处理8hr后细胞的M期同步化效率最好，达90％以上。 （三）Stra8，Setd8和H4K20mel在Stra8过表达细胞株在细胞周期不同阶段的表达。我们应用细胞免疫荧光和Western Bloting法检测Stra8过表达精原细胞细胞周期不同阶段Stra8，Setd8和H4K20me1的表达，发现在Stra8-GC1内，Stra8表达在G1期低，S期达到高峰，信号核质均有，在G2/M期表达降低;Setd8表达在G1期无表达，在S期后期开始表达，信号主要在细胞核，在G2/M期表达水平达高峰;H4K20me1表达模式与Setd8表达相似。经过表型分析与文献查阅我们猜测在细胞周期S期中，Stra8抑制E3泛素连接酶相关基因表达，CRL4Cdt2，SCFSkp2等，减弱其对Set8的降解作用，导致Setd8总体表达下降;而由于H4K20me1提前表达，反而导致H4K20me1总体表达水平提高。