羽毛降解菌株的分离鉴定及产酶研究

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日益发展的家禽养殖产业带来了大量羽毛废料,通常这些羽毛会被填埋或焚烧,造成环境污染问题的同时也浪费了蛋白质资源。传统的羽毛利用方式如通过高温高压水解生产饲料,则会消耗大量的能源,既不经济也不利于环保。角蛋白的微生物降解作为天然、高效的角蛋白降解途径由于其节能环保正在引起人们的重视,具有广阔的应用前景。本文以从湖南桑植一竹林散养鸡场采集的土样为试验材料,以羽毛粉作为唯一碳氮源,共分离得到44株对羽毛具有降解作用的菌株,其中一株编号为WYM39的菌株对羽毛的降解能力最强,能够在4天内完全降解100 m L液体羽毛培养基含有的1 g完整羽毛。此外还有一株既能降解羽毛,又能分解纤维素的菌株WYM40,由于其与WYM39分离自同一环境可以互为对照,同样对其进行深一步的研究。结合生理生化特征、形态观察、16S rDNA序列分析,初步鉴定菌株WYM39和WYM40均属于链霉菌属。对菌株WYM39的产酶条件和酶学特性进行研究,结果表明其最适发酵温度为30℃,最适发酵时间为96 h,最适初始pH为7.0,最适初始NaCl浓度为0%;粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为8.0,并能在60℃水浴30 min后保存89%的活性;Ca2+、Mg2+和K+浓度达到5 mmol/mL时能够抑制其粗酶液的酶活性,而反应体系中添加10μL/mL的β-巯基乙醇和10μg/m L的二硫苏糖醇能够增加数倍的酶活;PMSF能够抑制粗酶液的酶活,表明其属于丝氨酸蛋白酶。同时,表面活性剂SDS和有机溶剂异丙醇(可用作洗涤剂增溶剂)都对该粗酶液的酶活有促进作用,表明该角蛋白酶有应用于洗涤剂行业的潜力。此外,菌株WYM40的产酶条件和酶学特性试验结果显示,其粗酶液酶活虽然低于菌株WYM39,但产酶条件和酶学特性与菌株WYM39相近。Amycolatopsis sp.BJA-103是本实验室分离自缬草根际土壤中的菌株,能高效降解羽毛角蛋白。本研究将菌株BJA-103的粗酶液通过硫酸铵梯度盐析和DEAE-纤维素柱层析进行分离纯化,成功得到其中的一种角蛋白酶BJA-103-199,将该角蛋白酶的LC-MS检测结果与理论序列比对,确定了该酶的全酶氨基酸序列。对纯化的角蛋白酶BJA-103-199进行酶学特性研究,结果显示该酶的最适反应条件为60℃,pH 7,且在60℃水浴30 min后能保存54%的酶活;金属离子(Ca2+、Mg2+、K+,5-500μmol)、PMSF(1 mmol/mL)对其具有抑制作用,还原剂β-巯基乙醇(10μL/mL)、DTT(10μg/m L)可以增加其约二十倍的酶活;该酶可以降解多种底物,包括可溶的偶氮酪蛋白、酪蛋白、牛血清白蛋白、牛血红蛋白,和不可溶的天青角蛋白、羽毛粉。
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