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核糖体S6蛋白激酶2(Ribosomal protein S6 Kinase α3,RSK2)隶属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员,在TRL3诱导的先天免疫反应中发挥独特的作用。在哺乳动物中,RSK2具有一个负责底物的磷酸化的N-末端激酶结构域和一个参与自身磷酸化作用的C-末端激酶结构域。RSK2的C-末端激酶结构域存在一个ERK1嵌入的结构域,是ERK1与RSK2相互作用的重要位点。近几年,研究发现RSK2在癌症、细胞增值、细胞凋亡以及免疫应答中都发挥了相当重要的作用。然而RSK2在先天免疫和细胞凋亡上的研究仍然模糊不清。例如,紫外线辐射能够激活小鼠RSK2并磷酸化BAD的112位丝氨酸,从而调控细胞的凋亡。但是,RSK2抑制细胞凋亡并没有与凋亡相关基因BCL-2建立起任何联系。本研究主要探索鱼类MAPK通路中的ERK1-RSK2在先天免疫以及细胞凋亡中的激活机制和潜在功能。首先通过同源克隆的方法,从草鱼组织中克隆了ERK1(命名为CiERK1,MH985854)和RSK2(命名为CiRSK2,MH844551)的全长cDNA序列。CiERK1的开放阅读框(ORF)为1182bp,编码394个氨基酸的多肽,CiRSK2的ORF为2202bp,编码734个氨基酸的多肽。通过系统进化树分析表明,CiERK1和CiRSK2与大多数的硬骨鱼都有较近的亲缘关系,草鱼ERK1与鲤鱼ERK1具有最大的同源性,而草鱼RSK2与斑马鱼RSK2的同源性最高。蛋白结构分析表明,CiRSK2具有典型的二级结构,而且其ERK1的嵌入结构域在人、小鼠、斑马鱼之间都是保守的,因此说明草鱼RSK2可能与哺乳动物存在相似的功能。为了证明ERK1-RSK2能够响应TLR3诱导的先天免疫反应,在不同时间段下使用poly(I:C)刺激草鱼个体,然后分析8种不同组织中RSK2的表达量。结果显示,除了眼之外,CiRSK2的表达量都显著的上调,并在刺激48 h后达到最大的表达量。其中CiRSK2的表达量在鳃、肠、肾中最高,而在脑和眼中的表达量最低。相同的条件下,通过转染和孵育poly(I:C)的方法刺激草鱼肾细胞(CIK),并分析草鱼RSK2的表达量,发现转染poly(I:C)的刺激条件能够更加显著的上调CiERK1和CiRSK2的mRNA表达量,CiERK1的表达量在刺激24 h达到最大,而CiRSK2的表达量在刺激48h达到最大。为了进一步研究草鱼ERK1-RSK2的功能,通过孵育广谱磷酸化抗体发现poly(I:C)刺激能够使CiERK1发生磷酸化作用。免疫荧光测定和CO-IP实验显示,CiERK1与CiRSK2能够相互结合。在RSK2的亚细胞定位实验中,发现CiRSK2的亚细胞定位随着CiERK1刺激时间的延长逐渐由细胞质转移至细胞核。因此说明了活化的CiERK1与CiRSK2的相互作用能够促使CiRSK2进入细胞核。对于CiRSK2入核的生物学意义,首先在过表达和干扰CiR:SK2条件下,通过Q-PCR测定CiBCL-2的表达量,发现CiRSK2对CiBCL-2具有显著的正调控作用。然后通过双荧光素酶实验和CiBCL-2多克隆抗体孵育的Western blot实验,表明CiRSK2能够显著上调CiBCL-2的转录水平和蛋白水平。通过Hoechst 33258和TUNNEL检测细胞凋亡,发现CiRSK2在细胞凋亡上发挥了显著的抑制效果。因此CiRSK2抑制细胞凋亡可能是通过上调CiBCL-2。