非水介质对P.fluorescens/A.oryzae全细胞催化特性与细胞毒性影响的研究

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基于化学催化的工艺过程传统上被广泛应用于大宗化学品、精细化工、医药乃至食品行业中间体的生产制备。近年来,随着人们对食品、药品质量与安全的要求越来越高,研究者开始从生产工艺等源头上不断探索新型、绿色环保、安全低毒甚至无毒的工艺过程。生物催化技术因其反应条件温和、工艺绿色、环境友好等优点日益备受青睐。然而,生物催化法中酶催化技术的高成本很大程度上限制了其规模化的工业应用。全细胞催化剂则有效避免了游离酶繁琐的分离过程,不仅为细胞连接酶提供了天然细胞环境,更有利于其保持活性。然而,与目前酶法研究现状相比较,非水介质的全细胞催化研究较少,应用空间亟待拓展。不仅如此,非水介质对全细胞催化剂的毒性影响研究目前尚未见报道。基于上述研究现状,本论文以一类在医药和保健品领域均有重要作用的多羟基化合物--核苷类化合物的酯合成为模型反应,研究了微生物全细胞催化剂在非水相中催化酯合成反应的可行性;探讨了有机介质及新型溶剂离子液体对真菌及细菌型全细胞催化剂催化特性的影响方式及规律;研究了不同反应介质中荧光假单胞菌全细胞催化剂的底物识别特性;并深入探索了有机溶剂和离子液体对全细胞表面形态以及全细胞生长期细胞结构的影响;在此基础上,建立起适合不同底物酯合成反应的全细胞催化反应体系。研究发现,不同来源的全细胞催化剂在阿糖胞苷月桂酰化反应中体现出不同的催化特性。从7株细菌和11株真菌中成功筛选出4株具有催化反应能力的菌株,其中催化效率相对较高的细菌菌株为Pseudomonas fluorescens GIM1.209、真菌菌株为Aspergillusoryzae3.5232。非水介质的种类对全细胞催化剂的催化活性有着重要影响。在有机介质中,所筛选的全细胞催化剂活性均较低,但区域选择性高。在最佳混合有机介质异丙醚/吡啶(3:1,v/v)中,荧光假单胞菌全细胞催化反应的5’-区域选择性高于99%。当以纯离子液体为反应介质时,因高粘度引起的传质阻力使全细胞催化反应几乎不能进行;含离子液体混合溶剂的使用则大大提高了全细胞催化反应的活性及效率,且离子液体的阴离子和阳离子的种类对反应有着显著影响。在含[BMI][PF6]体系中,荧光假单胞菌全细胞催化反应初速率和产率达到最高,分别为2.34mmol/L h和81.05%;其次是在含[OMI][BF4]体系中,相应值分别为0.79mmol/L·h和32.1%;在含阴离子为卤素离子的离子液体体系中,全细胞无法催化酰化反应的进行。以米曲霉全细胞作为催化剂,催化阿糖胞苷月桂酰化反应中反应初速率和产率大小依次亦为[BMI][PF6]>[OMI][BF4]>阴离子为卤素离子的离子液体介质。在所研究的含离子液体介质中,全细胞催化反应的5’-区域选择性都始终高达99%以上。不仅如此,离子液体含量对全细胞催化阿糖胞苷月桂酰化反应也有明显影响。在荧光假单胞菌和米曲霉全细胞催化的酰化反应中,反应的初速度和产率均随着含[BMI][PF6]体系中离子液体浓度的增加而显著减少;而在含[OMI][BF4]体系中,由荧光假单胞菌催化的反应初速度和产率均随着离子液体浓度的增加而增加,但由米曲霉催化的反应效率则在离子液体含量为50%时达到峰值。在非水介质中,全细胞催化剂对不同结构的核苷底物呈现出不同的识别特性。荧光假单胞杆菌全细胞在催化一系列2’-脱氧核苷类似物酰化反应中,随着核苷底物5-位上取代原子极性的增强,全细胞催化剂的初速率、催化效率以及5’-区域选择性均呈现下降趋势;当2’-位存在羟基时,由于羟基的空间位阻效应,全细胞催化剂的催化效率有所下降,5’-区域选择性则相对升高。非水介质不仅通过影响全细胞催化剂中的细胞连接酶影响反应,且对细胞形态、结构及生长均产生毒性作用。经过有机溶剂处理后,荧光假单胞菌细胞表面出现了严重的皱缩现象,且有机溶剂能破坏细胞结构,影响细胞膜的通透性,并对生长也产生抑制影响;在对细胞形态的影响方面,细胞会明显增长,表面粗糙且有小凹陷或者细胞破损。有机溶剂对米曲霉细胞生长也有毒性影响,主要会影响米曲霉的生殖生长,在细胞形态方面,影响菌丝的长度、分枝和成球等。经离子液体处理后荧光假单胞菌细胞表面同样出现皱缩,并对细胞生长也产生毒性影响,且毒性大小与其类型密切相关。在所研究的离子液体中,[OMI][BF4]和[BMI][PF6]对细胞的生长抑制作用相对较低。在细胞形态上,5%离子液体的加入会使细胞细胞表面变粗糙,且在杆状细胞上出现横向环状凹陷,使细胞成链珠状,且细胞体积变化大。离子液体对米曲霉菌丝形态及生长也有明显影响,其中,含[BF4]-离子液体会完全抑制米曲霉的生长;含其它阴离子的离子液体中,卤素离子对菌丝体生长的抑制作用最小;无论对荧光假单胞菌还是米曲霉,[BMI][PF6]都具有较好的生物相容性,即其对两种微生物生长过程中细胞的形态和生长量影响都较小。本研究不仅丰富了全细胞催化的理论知识,也给溶剂工程的应用提供了数据支持,为以核苷为代表的多羟基化合物酯合成提供了一条新的―绿色‖合成途径;对全细胞催化技术在食品药品等生产制备安全性要求颇高的领域中的应用具有指导意义。
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