目前,肺癌的发生率呈逐渐升高趋势,且死亡率居恶性肿瘤首位。非小细胞肺癌(NSCLC,Non-small cell lung cancer)约占肺癌的85%,其中约70%的患者被诊断时已属晚期,肺腺癌是NSCLC最主要的亚型。近年来,尽管应用手术、放疗、化疗以及分子靶向药物治疗和生物治疗等治疗方法,使部分患者生存期延长,但NSCLC的预后仍较其它恶性肿瘤差。因此,迫切需要寻找预测和治疗肺癌的新靶点。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)基因是肺腺癌最常见的驱动基因之一。以往的研究已经表明,EGFR的异常活化可导致不受控制的细胞增殖、分化、转移和存活。EGFR通常在肺腺癌患者中过度表达,可影响肺癌患者的预后。在针对EGFR的治疗策略中,特别是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的使用,在有EGFR激活突变肺癌患者的治疗方面取得了较好的效果。然而,尽管大多数患者对这些TKIs表现出良好的反应,但对TKIs的抵抗也时常发生。因此,迫切需要寻找新的分子机制来干预EGFR信号通路,以确定新的治疗靶点来克服先天和后天的抵抗。(FilaminA,FLNa)是一种肌动蛋白结合蛋白,其作为支架蛋白,可与超过90多个的蛋白发生相互作用。通过与这些蛋白的相互作用,FLNa参与了多种细胞功能的调控,特别是迁移、侵袭和粘附。近年来,FLNa在癌症中的作用备受关注。大量的研究证实了FLNa对癌症的增殖、进展和转移的作用。FLNa最初被认为是一种促进癌细胞迁移、侵袭和转移的致癌基因。然而,最近的研究表明,根据其在细胞的定位,FLNa也可以在肿瘤的发展过程中发挥负作用。FLNa对癌症迁移和侵袭的作用依赖于它对信号通路的修饰。FLNa在ERK1/2和PKB/Akt信号通路调控中发挥了积极和消极作用,抑制FLNa可以减弱k-ras诱导的ERK和Akt通路的激活。已有报道,在黑素瘤细胞中,FLNa可与整合素蛋白结合调节PKB/Akt/ERK激酶的磷酸化。然而,FLNa对肺腺癌中EGFR信号转导的调节作用鲜见报道。基于EGFR信号通路在肺腺癌中的决定性作用和FLNa在肿瘤迁移和侵袭中的重要作用,我们推测,FLNa可能在肺腺癌的形成和发展中发挥重要作用。为证实此设想,我们利用人肺腺癌细胞系A549细胞,通过建立降低FLNa表达的稳定细胞株A549(KD)和对照稳定细胞株A549(ctrl);分别利用MTT法、划痕实验、侵袭实验检测降低FLNa的表达对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;利用蛋白印迹(western blot)技术检测EGFR、磷酸化EGFR(p-EGFR)、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的水平;分别将A549(KD)和A549(ctrl)稳定细胞株接种至裸鼠体内,观察降低FLNa的表达对A549细胞在裸鼠体内的生长及转移的影响;收集临床资料,观察人肺腺癌组织中FLNa表达与临床病理特征之间的关系。本研究从分子、细胞、动物实验和临床标本水平综合分析FLNa的表达对A549细胞生物学行为的影响,探讨FLNa调控EGFR信号通路活化的机制,研究结果将为肺癌的个体化治疗、预后判定提供有价值的分子检测指标,为肺癌的治疗提供新靶点。本研究分以下四部分:第一部分FLNa对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响目的:探讨FLNa对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:1体外培养敲低FLNa表达的A549(KD)稳定细胞株和对照A549(ctrl)稳定细胞株,提取细胞总RNA,采用实时定量PCR检测稳定细胞株中FLNa mRNA的表达水平;提取细胞总蛋白,采用western blot检测稳定细胞株中FLNa蛋白的表达水平。2采用MTT法检测A549稳定细胞株的增殖能力将A549稳定细胞接种至96孔板,血清饥饿培养4小时后,分别加入0n M、4n M、20nM EGF培养48小时,每孔加入MTT(5mg/ml),继续培养4小时,培养结束后,弃去上清液,加入DMSO振荡溶解后置于酶标仪490nm处检测各孔的OD值。3 A549稳定细胞株迁移能力检测3.1划痕修复实验检测A549稳定细胞株的迁移能力将A549(KD)和A549(ctrl)细胞分别接种于24孔培养板中培养24h后,血清饥饿培养4h,用移液器吸头划痕,PBS洗去漂浮的细胞,加入含或不含EGF(20nM)的1640培养基继续培养,于0h、4h、8h、12h和14h观察划痕宽度并拍照。3.2 Transwell法检测A549稳定细胞株的迁移能力用不含胎牛血清的1640培养基将A549(ctrl)和A549(KD)细胞浓度调至1×10~6/ml,分别接种于Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的1640培养基。将小室放入37°C细胞培养箱中培养24h,取出小室,弃去上室内培养基,棉签擦掉未穿过基质膜的细胞,PBS洗涤,95%酒精固定后HE染色,镜下观察并拍照。4 Transwell侵袭实验检测A549稳定细胞株的侵袭能力将基质胶均匀铺于Transwell小室的上室底面,用不含胎牛血清的1640培养基分别将A549(ctrl)和A549(KD)细胞浓度调至1×10~6/ml,分别加入Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的1640培养基。将小室放入细胞培养箱中培养24h后,95%酒精固定后HE染色,镜下观察并拍照,计数穿过基质胶的细胞。结果:1.实时定量PCR、Western blot检测A549稳定细胞株中FLNa mRNA及蛋白的表达水平实时定量PCR结果显示,A549(KD)细胞中FLNa mRNA的相对定量值(0.21±0.09)明显低于A549(ctrl)组细胞(1.00±0.00),有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示,A549(KD)组细胞中FLNa的相对表达量(0.31±0.01),明显低于A549(ctrl)组细胞(0.86±0.00),有统计学意义(P<0.01)。2.A549稳定细胞株的增殖能力MTT检测结果显示,A549(KD)组细胞在0n M、4nM、20nM EGF刺激下的OD值(0.57±0.05,0.66±0.03,0.70±0.01)均明显高于相应浓度EGF刺激的对照组A549(ctrl)细胞(0.37±0.02,0.44±0.02,0.45±0.03),均有统计学意义(P<0.01)。3.A549稳定细胞株的迁移能力划痕修复实验结果显示,在没有EGF刺激时,A549(KD)组细胞在4h的迁移率(10.42±2.87)高于A549(ctrl)组细胞(8.78±2.63),但无统计学意义(P>0.05);A549(KD)组细胞在8h、12h和14h的迁移率(26.80±4.01%,37.95±1.68%,40.19±2.90%)均高于A549(ctrl)组(12.57±0.89%,19.34±3.86%,23.59±2.74%),均有统计学意义(P<0.05)。给予20nM EGF刺激后,A549(KD)组细胞在4h的迁移率(16.97±4.47)高于A549(ctrl)组(8.50±2.98),但无统计学意义(P>0.05);A549(KD)细胞在8h、12h和14h的迁移率(29.73±2.17,44.74±4.81,50.00±0.00)明显高于A549(ctrl)组(18.69±1.06,29.46±3.66,37.75±2.71),均有统计学意义(P<0.05)。Transwell法检测A549稳定细胞的迁移能力结果显示,无EGF刺激时,A549(KD)组细胞的穿膜细胞数(636.33±28.02)明显多于A549(ctrl)组(471.00±49.12),有统计学意义(P<0.05);给予20nM EGF刺激后,A549(KD)的穿膜细胞数(697.67±109.89)明显多于A549(ctrl)组(474.33±50.36),有统计学意义(P<0.05)。4 Transwell法检测A549稳定细胞株的侵袭能力A549(KD)组细胞的穿膜细胞数(401.00±12.00)明显多于A549(ctrl)组(184.33±15.82),有统计学意义(P<0.01)。第二部分FLNa对肺腺癌A549细胞表皮生长因子受体活化的影响目的:探讨FLNa对肺腺癌A549细胞表皮生长因子受体活化的影响。方法:分别将A549(KD)和对照A549(ctrl)稳定细胞株(4×10~5/ml)接种于35mm培养皿中培养48h后,换为无血清的1640培养基饥饿培养4h,给予20nM EGF刺激后0min、5min、10min、30min,用预冷PBS冲洗细胞,加入预冷的RIPA裂解液提取总蛋白并定量,蛋白样本用于SDS-PAGE电泳,之后转至PVDF膜,加入5%脱脂奶粉封闭后,分别加入抗总EGFR、磷酸化酪氨酸、总ERK1/2、磷酸化ERK1/2、β-actin等一抗,4°C过夜,次日加入对应辣根或氧化物酶(HRP)标记的二抗,加入ECL发光底物显影,用Image J软件对蛋白条带灰度值定量分析。结果:利用western blot技术检测给予EGF(20nM)刺激0min、5min、10min、30min后EGFR信号通路蛋白的水平。结果发现,A549(KD)组细胞于EGF刺激5min、10min、30min后磷酸化EGFR(p-EGFR)的水平(1.05±0.00,1.05±0.01,0.60±0.02)均明显高于A549(ctrl)组(0.90±0.00,0.65±0.01,0.16±0.00),均有统计学意义(P<0.01);A549(KD)组细胞于EGF刺激0min、5min、10min、30min后磷酸化ERK1/2的水平(0.05±0.00,1.01±0.00,1.09±0.00,0.82±0.00)均显著高于对照组(0.04±0.00,0.57±0.00,0.66±0.01,0.66±0.01)(P<0.01)。第三部分FLNa对A549细胞在裸鼠体内生长、转移的影响目的:探讨FLNa对A549细胞在裸鼠体内生长、转移的影响。方法:分别将100μl A549(KD)和A549(ctrl)细胞(1×10~7/ml)接种至5周龄BALB/c裸鼠右侧背部皮下,每组6只小鼠,接种后每3天称量裸鼠体重、用卡尺测量肿瘤长径(a)和肿瘤短径(b),按公式(V=a×b~2×0.52)计算肿瘤体积。接种28天后,处死全部小鼠,剥离肿瘤组织、肺脏及肝脏。将瘤体切割成两部分,一部分经4%多聚甲醛固定后用于免疫组织化学法检测移植瘤组织中FLNa、磷酸化EGFR(p-EGFR)、Ki67的表达;另一部分用于提取瘤组织蛋白,采用western blot技术检测FLNa、磷酸化EGFR(p-EGFR)、EGFR、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)及ERK1/2的表达。结果:1.敲低FLNa表达对A549细胞在裸鼠体内生长、转移的影响将A549(KD)和A549(ctrl)细胞分别接种至裸鼠1周后,每只裸鼠均出现3mm大小的肿瘤,成瘤后,裸鼠肿瘤体积随时间的延长而逐渐增大,与A549(ctrl)组细胞相比,A549(KD)细胞在裸鼠体内的生长速度明显增快(P<0.01)。接种28天后处死裸鼠,剥离肿瘤组织称重发现,A549(KD)组瘤组织重量明显大于A549(ctrl)组,有统计学意义(P<0.01)。取出肝脏和肺脏,两组小鼠的肝脏和肺脏均未发现有转移瘤。2.Western blot检测移植瘤组织中的蛋白表达情况利用蛋白印迹法检测移植瘤组织中的蛋白表达水平,ImageJ软件扫描条带,统计结果发现,A549(KD)组FLNa的表达水平(0.14±0.02)明显低于A549(ctrl)组(1.45±0.03)(P<0.01);A549(KD)组pY-EGFR、p-ERK1/2的相对表达水平(1.72±0.25,1.59±0.03)均明显高于A549(ctrl)组(0.32±0.52,0.52±0.01)(P<0.01)。3.免疫组织化学法检测移植瘤组织中蛋白的表达情况结果显示,Ki67染色阳性信号主要位于细胞核,FLNa、p-EGFR染色阳性信号主要位于细胞膜和胞浆。与A549(ctrl)组相比,A549(KD)组瘤组织中FLNa的表达明显降低,而p-EGFR、Ki67的表达明显增高。第四部分FLNa在肺腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性目的:探讨FLNa在肺腺癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性。方法:从白求恩国际和平医院病理科选取28例肺腺癌组织标本,采用免疫组织化学法检测FLNa表达情况,并分析FLNa的表达水平与肺癌临床病理特征的关系。结果:1.FLNa在肺腺癌组织中的表达情况采用免疫组织化学法检测FLNa在肺腺癌组织中的表达情况。光镜下观察FLNa染色情况,可见其分布于肺腺癌细胞、血管内壁及部分间质组织,其中肺腺癌细胞着色情况为本部分实验观察目标。FLNa定位于肺腺癌细胞胞膜和胞浆,表现为由浅黄至棕褐色颗粒沉着,呈弥漫或散在分布。2.FLNa表达与肺腺癌患者病理特征的关系在28例肺腺癌患者组织中,FLNa蛋白的表达与肿瘤大小、淋巴结转移数目和临床分期均无统计学差异(P>0.05)。结论:1.敲低FLNa表达可增强人肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力。2.敲低FLNa表达可通过增强EGF诱导的EGFR酪氨酸磷酸化及其下游ERK信号通路的转导促进人肺腺癌A549细胞的生长。3.敲低FLNa表达可促进人肺腺癌A549细胞在裸鼠体内的成瘤生长。4.不同病理特征肺腺癌FLNa的量表达不一,FLNa可能在肺腺癌发生、发展中起一定作用。