复合诱变筛选制备富有机铁啤酒与牦牛肽活性成分初步研究

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铁是人体需要量最大,而又最易发生代谢障碍的微量元素,目前微量元素啤酒保健作用已被世界各国所重视,但是我国啤酒品种仍过于单一,高品质啤酒基本无市场占有。本研究利用经过诱变处理后的啤酒酵母,转化获得有机微量元素铁并添加啤酒,以期获得富有机铁保健啤酒。据《本草纲目》载:“牛角,酸咸、清凉、无毒”,主治:治惊痫,热毒,诸血病;具有清心,解热,镇静,镇痉。牦牛角是珍贵的藏药材之一,在藏区被长期用于发热解痉的诊疗,但是牦牛角解热镇痛的物质基础研究尚未见报道。本研究通过对牦牛角解热镇痛活性物质的初步研究,为获得一种新的解热镇痛类蛋白类多肽药物提供研究资料。本论文主要的内容包括:1.耐高铁菌株的复合诱变由本院微生物实验室提供的啤酒酵母作为出发菌株,通过紫外-DES-γCo60(紫外-硫酸二乙酯-γCo60)进行物理化学复合诱变,通过平板法进行初筛和复筛后,最终获得一株耐铁量较出发菌株高的菌株且生物性状稳定的菌株;2.Fe2SO4(硫酸亚铁)和抗氧化剂(Vc)的混合流加培养及发酵工艺优化为了防止发酵过程中Fe2SO4的氧化本实验采取抗氧化剂和Fe2SO4的混合流加。通过菌种生长和菌株对铁的富集量因素的筛选研究来确定最佳的抗氧化剂浓度及流加工艺,并讨论了最佳接种量,发酵温度,pH值等发酵工艺参数对菌体生长。实验最终获得最佳的流加工艺:抗氧化剂的最佳浓度为10%,流加工艺为:抗氧化剂在发酵初期直接加入Fe2SO4分批加入,发酵工艺条件为:接种量10%,pH5.5,发酵温度30℃。3.富有机铁啤酒的制备收集菌体采用反复冻融使其破壁获得有机铁并将其添加至啤酒中制得有机铁啤酒,实验后期测定有机铁啤酒的理化特性及稳定性研究,结果显示无机铁添加具有铁腥味影响口感且不易吸收的缺点,通过稳定性的研究发现有机在长期保存中亚铁的含量无损失且啤酒中无沉淀出现。成功制得了有机铁含量为3mg/L,符合饮用标准的有机铁保健啤酒。4:采用西部特有藏药材牦牛角为原料,粉碎热提取得粗品,采用皮下酵母注射法建立小鼠发热模型,热板法评价解热活性,并采用热板法和醋酸扭体法评价镇痛活性,结果显示牦牛肽粗提物的痛阈值在50%以上具有镇痛活性。样品透析后的热板法活性提示,样品的活性主要生物大分子。5:分别采用酸碱提取,分步盐析,非变性电泳,膜分离,分子筛层析(S-300),疏水层析,离子交换层析(DEAE)等方法进行热提液中活性成分的分离,并跟踪分离产物的解热镇痛活性。最终确定牦牛活性肽为小于30Kd的小肽,并确定了初步的分离方案,为进一步的深层次研究提供了技术资料。
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