青贮制作历史悠久,由于青贮具有便于制作保存,利于动物消化吸收,可作为缺乏新鲜牧草季节的替代饲料,因此受到越来越多的关注。青贮过程伴随着大量微生物的繁殖代谢,而不同微生物的繁殖代谢会对青贮品质产生影响。本文以Lactobacillus plantarumP-8作为苜蓿青贮发酵剂,按照实际裹包靑贮制作流程共制作50个青贮包。采用传统培养方法对青贮过程中微生物的动态变化研究发现,青贮过程中乳酸菌活菌数快速升高,而梭菌、大肠菌群、酵母菌和霉菌等青贮有害微生物活菌数明显降低。在此过程中,苜蓿青贮中的乳酸、乙酸、苯乳酸以及丫-氨基丁酸含量增加,降低了中性洗涤纤维,抑制了蛋白质降解,提高了饲料品质和安全性。采用PacBio单分子实时测序技术并结合PMA技术对青贮微生物多样性进行研究,从青贮样品中共鉴定到278个细菌属,544个细菌种,82个真菌属和95个真菌种。通过对青贮过程微生物的动态变化研究发现,Lactobacillus plantarum在青贮7天后成为优势菌种,并协同 Weissella jogaejeotgali、Weissella paramesenteroides、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus brevis和Pediococcus pentosaceus等细菌种形成核心菌群,上述菌群对青 贮中的 Weissella、Parntoea、Erwinia、Pseunodmoas 和Staphylococcus 等细菌属以及 Volutella、Cryptococcus、Leucosporidium 和Fusarium等真菌属具有显著抑制效果。采用Spearman相关性分析对传统青贮理化指标和微生物菌群的关系进行研究,从种水平上阐述了乳酸菌对青贮品质的有益作用。基于Illumina HiSeq 4000平台,通过宏基因组测序结果及功能基因组研究表明,Lactobacillus plantmaru与产乳酸、苯乳酸和乙酸等代谢物的相关功能基因呈正相关,与产丁酸的相关功能基因呈负相关。Lactobacillus plantarum和Lactobacillus brevis与产γ-氨基丁酸相关功能基因呈正相关。这些结果表明Lactobacillus plantarum是影响整个功能基因代谢网络关系的重要因素。在基因水平上,青贮发酵过程中COG功能大类中的E(氨基酸运输和代谢)、L(复制、重组和修复)、G(碳水化合物运输和代谢)、J(翻译、核糖体结构和生物合成)、H(辅酶运输和代谢)、P(无机粒子运输和代谢)、T(信号转导机制)、F(核苷酸转运和代谢)、M(细胞壁/膜/包膜生物合成)等相对含量较高。发酵后碳水化合物酶多样性明显增加,糖苷水解酶和多糖裂解酶含量显著升高。基于KEGG数据库对不同阶段代谢通路的变化进行分析发现,青贮7天的发酵过程中谷氨酸代谢、丙酮酸代谢、果糖和甘露糖代谢、糖酵解以及细胞周期(细胞生长和死亡)等通路活跃,表明微生物存在相互竞争抑制现象;对发酵7至14天的代谢通路比较发现,发酵14天时代谢通路中的功能基因活跃;对发酵14至28天的代谢通路比较发现,所有的代谢通路功能基因在发酵14天时活跃,至28天时已经进入稳定期,微生物代谢减缓。总之,采用PacBio单分子实时测序技术和基于Illumina HiSeq 4000平台的宏基因组测序,可以更准确了解青贮过程中微生物菌群及其功能基因的变化情况,为青贮发酵剂的研究开发提供新思路。