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作为一种丝状真菌,绿僵菌可以用于植物病害和植物虫害的防治。然而,这些基于分生孢子的真菌杀虫剂在杀虫剂市场所占总的份额还很小,主要原因是由于绿僵菌与其他虫生真菌杀虫剂一样,杀虫时效长、防效易变化、保质期不长等是其缺点。因此,有必要深入研究绿僵菌抗逆和致病的调控机理,寻找与抗逆和致病相关的重要途径及关键基因具有重要意义。本实验室之前完成了绿僵菌孢子热胁迫过程中的全基因差异表达谱,结果发现绿僵菌孢子热胁迫过程中存在数千上调基因,其中绿僵菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（Serine/threonine protein kinase,MrArk1）显著上调表达。首先,本研究对绿僵菌MrArk1基因做生物信息学分析;其次,利用同源重组的原理,采用农杆菌介导的转化技术,获得MrArk1的基因敲除株（△MrArk1）和回补株（△MrArk1::MrArk1）;最后,通过比较敲除突变菌株（△MrArk1）与野生型菌株（Mr2575）、回补突变菌株（△MrArk1::MrArk1）在生长发育、产孢量、抗逆和毒力等方面的差异,从而明确MrArk1基因的生物学功能。主要的研究结果如下:1.在NCBI中搜索MrArk1的全长序列,进行生物信息学分析,比对构建系统发育树,表明其与白僵菌和稻瘟病菌等真菌有很高的亲缘性。2.比较Mr2575、△MrArk1和△MrArk1::MrArk1在生长发育方面的差异,分别在PDA、SDAY和1/4 SDAY培养基上培养,及在完全培养基CM、最小培养基MM-C和缺氮MM-N培养基上培养,观察敲除突变体的菌落颜色和形态、测定菌落生长直径,计算不同菌株产孢量。同时每隔相同的时间观察突变体和野生型菌株的萌发率,得出相对萌发时间。结果显示敲除突变体菌株（△MrArk1）与野生型菌株（Mr2575）和回补突变菌株（△MrArk1::MrArk1）的颜色和形态相比差异明显,敲除突变体与野生型菌株和回补突变菌株直径相比下降明显,产孢量显著下降。说明绿僵菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（Ark1）对真菌的生长发育起到至关重要的作用。同时,比较敲除突变体菌株和野生型菌株及回补突变菌株的萌发时间,敲除突变体菌株推迟了2小时左右。3.对上述三个菌株进行逆境胁迫实验分析:将它们的孢悬液分别用40℃和45℃处理1小时和紫外照射处理,及在含不同化学试剂的PDA培养基上培养,结果表明缺失丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Ark1）对外界温度的变化更敏感。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Ark1）不参与抵御紫外的过程。敲除突变体菌株对刚果红等细胞壁胁迫因子耐受性增强,参与细胞壁完整性的调控,对过氧化氢和甲萘醌耐受性增强,参与氧化应激的调控,对多菌灵耐受性增强,对盐胁迫耐受性没有变化。4.用这三种菌株的孢悬液侵染大蜡螟,测定大蜡螟的存活率,通过存活率推出虫体的半致死时间。结果显示野生型绿僵菌的半致死时间(LT50)为6.3d,突变体的半致死时间(LT50)为7.9d,回补株的半致死时间(LT50)为6.9d,与野生型菌株（Mr2575）相比,敲除突变体菌株（△MrArk1）侵染大蜡螟的能力减弱,即敲除突变体的毒力降低。5.因为内吞染料FM4-64可以进入顶体,作为评价内吞性囊泡运输过程的指标,本研究以FM4-64作为指示剂,对野生型菌株（Mr2575）和敲除突变株（△MrArk1）菌丝体的顶端进行染色,结果表明,在野生型菌株（Mr2575）菌丝顶端可以明显观察到红色荧光,但敲除突变体菌株（△MrArk1）中没有观察到任何荧光,表明丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Ark1）参与绿僵菌胞吞作用的发生形成。综上所述,敲除突变体菌株（△MrArk1）的产孢量显著降低,毒力降低,相对萌发时间推迟,这些结果说明绿僵菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（MrArk1）参与真菌的生长发育和致病过程。