背景:自杀是指个体心理危机发展到严重程度时自愿采取各种手段结束自己生命的一种行为。自杀作为一种非正常的死亡情况,不只是给当事人的整个家庭带来了痛苦,同时也带给社会和国家造成了沉重的经济负担,自杀已经成为当今最严重的公共卫生问题之一。多项研究证实抑郁症患者是自杀的高危人群,约占全部自杀案例的一半以上,同时,自杀也是抑郁症最严重的后果。而对重型抑郁患者的自杀行为进行提前预警的研究则是目前的研究热点之一。迄今为止,对重型抑郁患者自杀行为的预警方式主要还是通过量表筛查,但由于量表受主观因素影响较大,而且有自杀意愿者往往隐藏自己的真实想法,因此急需开发出可对自杀行为进行预警的客观分子标志物。近年来,也有多项研究致力于此,如研究自杀患者脑脊液中5-羟色胺的代谢产物5-羟吲哚乙酸的表达水平、地塞米松抑制实验的异常以及血浆中胆固醇、ω-3脂肪酸以及脑源性神经营养因子降低等。但尚没有一种分子标志物能够有效的对重型抑郁的自杀行为进行预警。1目的:本研究拟采用基于比较蛋白质组学的方法(2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术联合i TRAQ技术)筛查重型抑郁伴自杀行为患者血浆中的差异蛋白,并在临床样本中对其进行验证,在动物实验中对其相关分子机制进行探讨,以期进一步阐明重型抑郁伴自杀行为的病理生理机制。方法:1.制定严格的疾病纳入及排除标准,在重庆医科大学附属第一医院精神科收集重型抑郁患者、重型抑郁伴自杀行为患者的血浆标本,同期在体检中心以收集正常对照者的血浆标本。规范样本的采集、处理及保存流程,认真完成相关病例资料的记录和归档。2.采用基于2-DE结合MALDI-TOF/TOF的技术联合i TRAQ技术筛选重型抑郁伴自杀行为患者的血浆差异蛋白,通过生物信息学分析发现可用于预警重型抑郁伴自杀行为的分子标志物及其相关机制。3.使用WB技术以及ELISA技术在独立临床样本以及扩大的临床样本中对分子标志物进行验证。4.在动物水平对分子标志物及相关病理生理机制进行进一步的验证和探讨。结果:1.根据排除纳入标准共收集到61例重型抑郁患者(40例使用抗抑郁药,21例未使用抗抑郁药)、61例重型抑郁伴自杀行为患者以及61例正常对照者的血浆标本。2.选取12例首发未用药的重型抑郁伴自杀行为组、12例重型抑郁组以及12例正常对照组的血浆样本,先进行去除高丰度处理,然后采用基于2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术,使用3-10以及4-7两种p H值范围互补的胶条进行双向凝胶电泳图谱的构建,通过PDQuest软件分析,p H3-10图谱上共分离得到约1100个点,p H4-7图谱上共分离得到约1200个蛋白点,在两种p H范围的胶条上总共鉴定到33个差异蛋白点可将三组区分开,相较于重型抑郁组,在重型抑郁伴自杀行为组中有6个差异蛋白点表达上调,有27个差异蛋白点表达下调,最后通过质谱鉴定得到25个独立蛋白点。3.选取与前述相同的36例血浆样本进行去除14种高丰度蛋白的处理,然后采用i TRAQ技术,对三组的血浆差异蛋白进行分析。以改变倍数≥1.2倍,且p<0.05作为纳入标准。三组间进行比较,最终筛选到20个差异蛋白点可将三组完全区分开。i TRAQ技术与2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术中鉴定到的差异蛋白无重合。4.使用Meta Core软件对基于2-DE技术以及i TRAQ技术鉴定到的共45个差异蛋白点进行生物信息学分析,以发现显著富集的通路,并构建相关的分子网络。通过分析发现45个差异蛋白在“凝血途径”以及“免疫反应途径”有显著的富集(p<0.001),人工筛选后发现有28个差异蛋白参与这两条分子途径中发挥作用。5.使用WB技术对蛋白质组学中发现的有商业化抗体的25个差异蛋白进行独立样本的验证,其中有四个蛋白,SAA1,CRP,FⅩ以及PCI可将重型抑郁伴自杀行为组与其他两组区分开。其他的候选蛋白在三组之间的表达均无差异。6.使用ELISA技术在147例独立临床样本中对七个外源性凝血途径的关键蛋白进行ELISA验证,包括TF,TFPI,FⅦ,APC,FⅤ,F1+2以及凝血酶原。结果显示有6个分子可将重型抑郁伴自杀行为患者与其他组区分开。FⅦ,FⅤ,APC,TF以及TFPI这5个分子在重型抑郁伴自杀行为组中的表达显著升高,FⅦ的表达规律为重型抑郁伴自杀行为组>正常对照组>重型抑郁组,其余四个分子的表达规律为重型抑郁伴自杀行为组>重型抑郁组>正常对照组,F1+2因子的表达呈现出特别的规律:正常对照组>重型抑郁伴自杀行为组>重型抑郁组。凝血酶原在三组之间的表达无差异。7.为更准确的了解凝血酶原酶的相对活化水平,我们采用伽马函数对其相对质量反应活性比进行计算。计算结果显示,凝血酶原酶相对质量反应活性比呈现出:正常对照组(2.13)>重型抑郁伴自杀行为组(1.34)>重型抑郁组(1.00)的规律。8.使用肝素连续进行7天腹腔注射造成SD大鼠低凝状态模型,造模完成后肝素注射组a PTT的表达较生理盐水组有明显延长(p=0.0237),行为学评价发现肝素注射组SD大鼠在强迫游泳实验中的不动时间较生理盐水组有明显延长(p=0.0295)。结论:1.严格的纳入排除标准是后续客观分子标志物及分子机制筛查和验证的重要基础。2.综合采用两种蛋白质组学技术在重型抑郁伴自杀行为患者的血浆中寻找差异蛋白,可以对发现分子标志物的信息进行相互补充,最大程度发挥蛋白质组学发现疾病诊断标志物的优势,以免在筛选初期就遗漏重要的信息。3.通过蛋白质组学策略发现45个差异蛋白主要富集到凝血和炎症反应两个生理途径中,提示重型抑郁伴自杀行为患者有凝血及免疫系统的紊乱,而且有28个差异蛋白参与到这两条途径中,提示这些差异蛋白可作为分子标志物进行下一步探讨。4.在独立临床样本中的WB验证结果表明,重型抑郁伴自杀行为患者处于高炎症反应状态,同时其凝血相呈现出,高于重型抑郁,低于正常对照组的“中间态”。在扩大临床样本中的ELISA验证结果表明外源性凝血途径相关分子可能是预警重型抑郁伴自杀行为的分子标志物,而且机体的凝血状态可能与重型抑郁伴自杀行为密切相关。5.在肝素注射造成低凝状态的SD大鼠模型上,观察到了显著的绝望行为,而绝望水平被认为是人类重型抑郁患者发生自杀行为的主要危险因素之一,因此,我们进一步在体证明凝血状态与促使重型抑郁自杀行为发生的危险因素有密切相关性。