近年来,糖尿病,尤其是Ⅱ型糖尿病已经成为危害人类生命的重大疾病之一。研究表明,α-葡萄糖苷酶的活性是产生餐后高血糖的关键因素,因而抑制α-葡萄糖苷酶的活性成为临床降低餐后高血糖,治疗2型糖尿病的主要途径之一。由于临床中用于治疗糖尿病的主要药物—阿卡波糖等会对不同的病人存在一定的副作用,因而使得其应用受到限制。因此,寻找毒副作用低的天然中草药有效成分作为新的α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为当前研究的趋势。本论文采用紫外光谱法、荧光光谱法、同步荧光光谱法和圆二色谱法(CD)以及分子模拟技术,研究山奈酚、杨梅素和染料木素等3种黄酮化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用、结合性质及其对α-葡萄糖苷酶结构的影响,探讨了这3种黄酮化合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制机制。由于黄酮化合物的不稳定和易降解,为了提高黄酮化合物的稳定性,保护其生物活性,本文研究应用牛血清白蛋白/?-卡拉胶作为于黄酮化合物的包埋载体,对山奈酚、杨梅素或染料木素进行包埋,构建了黄酮化合物(山奈酚、杨梅素或染料木素)-牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒体系,分别考察了经过牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒包埋前后的山奈酚、杨梅素和染料木素的稳定性及其对DPPH自由基的清除能力,研究了模拟胃肠道消化环境下黄酮化合物的释放情况及其对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。主要研究内容和结果概述如下:1、研究了山奈酚、杨梅素、染料木素对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,分别测定了山奈酚、杨梅素和染料木素对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)、抑制类型和抑制常数。结果表明,山奈酚、杨梅素和染料木素都是可逆的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并且3种黄酮对α-葡萄糖苷酶都有较好的抑制效果且都大于阳性对照阿卡波糖(IC50=(2.09±0.03)×10-4),其半抑制浓度IC50值分别为(0.68±0.02)×10-5、(1.16±0.04)×10-5和(1.89±0.01)×10-5 mol L-1(n=3),抑制α-葡萄糖苷酶能力依次为杨梅素>山奈酚>染料木素。山奈酚是一种混合型α-葡萄糖苷酶抑制剂,杨梅素为竞争型抑制剂,染料木素呈现出非竞争型抑制,它们对α-葡萄糖苷酶抑制常数Ki分别为(1.31±0.03)×10-5、(1.59±0.04)×10-5和(1.26±0.02)×10-5(n=3)。2、联合应用紫外和荧光光谱法并结合分子模拟手段研究了上述3种黄酮化合物与α-葡萄糖苷酶的结合性质。结果表明,山奈酚、杨梅素、染料木素都能很好的猝灭α-葡萄糖苷酶的内源荧光,与α-葡萄糖苷酶结合,并且该3种黄酮与α-葡萄糖苷酶都只存在一个结合位点(n值近似等于1)。由非辐射能量转移理论计算出山奈酚、杨梅素、染料木素与α-葡萄糖苷酶结合距离r分别为3.05、3.25和2.61nm,均小于临界值8nm,且0.5r0<r<1.5r0,表明α-葡萄糖苷酶分别与这3种黄酮的结合过程中存在非辐射能量转移。另一方面,获得的r>r0,说明这3种黄酮可能处在α-葡萄糖苷酶发光基团附近的位置,从而强有力的猝灭了酶的荧光。分子模拟结果显示,山奈酚、杨梅素直接插入到α-葡萄糖苷酶的疏水空腔,通过疏水作用和氢键范德华力与周围的氨基酸残基(asp69,phe178,asp215,glu277,his351,asp352,arg315,phe314andval410)结合,占据了酶的活性中心,阻碍了底物硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)的进入,从而对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用。3、采用同步荧光光谱法和cd光谱法研究山奈酚、杨梅素、染料木素与α-葡萄糖苷酶结合后对酶结构的影响。发现随着山奈酚、杨梅素、染料木素的分别加入,α-葡萄糖苷酶的色氨酸和酪氨酸所处微环境有了微小的改变,并且α-葡萄糖苷酶的二级结构α-helix的含量均呈现增大趋势,分别由30.8%增大到34.2%,32.2%到36.7%,31.5%到32.2%。表明山奈酚、杨梅素、染料木素与α-葡萄糖苷酶结合破环了酶的氢键网状结构,使酶二级结构发生改变,阻碍酶活性中心的形成并且阻止底物的进入,最终导致酶催化降低。该3种黄酮化合物诱导α-葡萄糖苷酶二级结构变化是其抑制酶活性的另一原因。4、以牛血清白蛋白/?-卡拉胶为载体,分别制备山奈酚–牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒、杨梅素–牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒、染料木素–牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒,牛血清白蛋白/?-卡拉胶颗粒平均粒径为110±3nm,且粒径均一,电动势为–35.2±0.2mv。加入山奈酚、杨梅素、染料木素3种黄酮化合物后,其包埋物纳米颗粒平均粒径分别为136±4nm、145±2nm和121±2nm,电动势分别为–32.2±0.5mv、–40.5±0.3mv和–27.8±0.4mv。山奈酚、杨梅素、染料木素的包埋率分别为78.41%、89.67%和71.59%。3种黄酮与牛血清白蛋白/卡拉胶颗粒均有很强的结合能力,结合常数分别为1.67×105、2.60×105和0.85×105lmol-1,结合蛋白质的能力依次为杨梅素>山奈酚>染料木素,与黄酮化合物b环上的羟基数有关。经过牛血清白蛋白/卡拉胶颗粒包埋的山奈酚、杨梅素和染料木素的稳定性比游离的黄酮明显提高,但清除dpph自由基的能力有所减弱,这可能是这些黄酮化合物与蛋白的内部通过氢键和疏水作用力结合,阻止了黄酮提供H+以消除自由基。经模拟胃肠道消化后,山奈酚、杨梅素、染料木素在胃液(pH 2.0)消化过程中(0–4 h)的释放量分别为9.76%、11.35%和8.92%。继续经过肠液(pH 7.6)消化10 h后,3种黄酮在肠液中的释放率分别为19.54%、46.74%和26.54%。该结果可能是由于消化环境pH值发生变化(由pH 2.0–7.6),使得离子强度增强,从而直接影响牛血清白蛋白的结构,改变了牛血清白蛋白与黄酮化和物的结合性质。且释放后的山奈酚,杨梅素和染料木素都表现为一定的抑制α-葡萄糖苷酶能力,当抑制能力趋于平缓时,山奈酚,杨梅素和染料木素的浓度分别为1.79×10-5 mol L-1,0.85×10-5 mol L-1和2.81×10-5 mol L-1,对α-葡萄糖苷酶的抑制百分数分别为56.7%,39.6%和31.2%。