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1997年StoneEM等于《science》杂志上首次报道Myocilin基因为原发性开角型青光眼的致病基因,自此掀起开角型青光眼发病机制的新的研究热潮。然而,到目前为止,Myocilin基因突变是否是家族性开角型青光眼的确切致病基因仍众说纷纭,存有争议。
1985年,葛坚教授在我国首次确立家族性开角型青光眼大家系—广州1号(GZ.1)。此后,其所带领的课题组对该家系进行了长达20年的追踪调查,并展开一系列全面、系统的临床及实验室研究,确定Myocilin基因P370L突变是GZ.1家族性开角型青光眼的致病基因,该家系患者中P370L突变频率为100%;进而,GZ.1家系密切相关的P370L突变型Myocilin蛋白功能的初步研究显示P370L突变型Myocilin蛋白细胞外分泌障碍,在胞浆内形成积聚体(aggresomes)引起人小梁细胞收缩、粘附、迁移功能的改变。然而,P370L突变型Myocilin究竟通过何种病理途径损伤人小梁细胞结构和功能,进而导致GZ.1家族性开角型青光眼的发病尚不清楚。
本研究为阐明P370L突变型Myocilin的人小梁细胞损害机制,通过构建P370L突变型Myocilin基因真核表达载体,瞬时转染人小梁细胞,建立P370L突变型Myocilin体外功能研究模型,经系统分子生物学方法检测发现P370L突变型Myocilin调控人小梁细胞内质网应激反应,扰乱其蛋白质合成及分泌功能,同时损伤线粒体结构及功能,导致人小梁细胞形态异常,细胞粘附性下降,细胞死亡。另外,我们还发现P370L突变型Myocilin上调人小梁细胞内质网应激反应通路—糖蛋白内质网相关性降解反应,在早期损伤同时激发细胞保护性反应。
据此,我们证实P370L突变型Myocilin蛋白因蛋白错误折叠,构象改变而获得病理性功能,通过调控内质网及线粒体功能引发人小梁细胞级联病理反应。本研究初步揭示P370L突变型Myocilin的人小梁细胞损伤机制,为其完全释解提供确实的实验依据,同时为GZ.1家族性开角型青光眼发病机制的研究以及有效防治措施的发展提供新思路。
目的:通过在体外人小梁细胞中特定表达P370L突变型Myocilin蛋白,检测其因错误折叠,构象改变对人小梁细胞内质网及线粒体功能的调控作用,探讨P370L突变型Myocilin对小梁细胞的损伤机制,为释解P370L突变型Myocilin的致病机制提供实验依据,同时为GZ.1开角型青光眼家系发病机制的研究以及有效防治措施的发展提供新思路。
方法
1.应用定点诱变技术构建P370L突变型MYOC真核表达载体,通过阳离子脂质体将pcDNA3.1载体,pcDNA-wild-type-MYOC载体及pcDNA-MYOC-P370L载体体外瞬时转染人小梁细胞;
2.应用RT-PCR检测人小梁细胞Myocilin、GRP78、ATF4、ATF6及XBP1mRNA的表达;
3.应用Westernblot检测人小梁细胞Myocilin蛋白及内质网伴侣蛋白GRP78蛋白、XBP1蛋白、Phospho-eIF2alpha蛋白的表达;
4.应用细胞免疫化学染色法通过共聚焦显微镜观察GRP78蛋白与Myocilin蛋白的共定位情况以及Paxillin的表达;
5.应用MTT法检测人小梁细胞代谢率;
6.应用JC-1染色法通过流式细胞仪及共聚焦显微镜检测人小梁细胞线粒体膜电位;
7.应用AnnexinV/PI染色法通过流式细胞仪检测人小梁细胞磷脂酰丝氨酸外翻;
8.应用倒置相差显微镜和透射电镜进行人小梁细胞形态及超微结构的观察。
结果
1.酶切及测序鉴定确定pcDNA-MYOC-P370L真核表达载体阅读框及突变位点正确。
2.RT-PCR及Westernblot检测结果显示pcDNA-wild-type-MYOC载体及pcDNA-MYOC-P370L载体转染后人小梁细胞MyocilinmRNA及Myocilin蛋白表达显著增加。
3.RT-PCR及Westernblot检测结果分别显示pcDNA-MYOC-P370L载体转染组与pcDNA3.1空载体转染组相比人小梁细胞内质网应激分子GRP78mRNA、GRP78蛋白质及Phospho-eIF2α蛋白表达显著减少,XBP1mRNA及XBP1蛋白质表达显著增多;而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组无明显变化。
4.pcDNA-MYOC-P370L载体转染组人小梁细胞MTT代谢率为(72.6±3.8)%明显低于pcDNA3.1空载体转染组(92.5±4.2)%,两组相比MTT代谢率的差异有统计学意义(P<0.05);而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组无明显改变。
5.pcDNA-MYOC-P370L载体瞬时转染人小梁细胞荧光探针JC-1的红色/绿色荧光强度比值(1.4±0.3)显著低于pcDNA3.1空载体转染组(3.2±0.4)(P<0.01);而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组无明显变化。共聚焦显微镜观察显示各组均无细胞色素C的释放。
6.共聚焦显微镜观察显示pcDNA-MYOC-P370L载体转染组人小梁细胞Paxillin蛋白质的表达量与pcDNA3.1空载体转染细胞相比明显减少;而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组其表达无明显改变。
7.AnnexinV/PI双标法结果显示pcDNA-MYOC-P370L瞬时转染后,人小梁细胞FITC-AnnexinV(+)/PI(-)细胞占总细胞的百分率为(47.09±4.16)%,与pcDNA3.1空载体转染组相比明显增高(12.38±1.18)%(P<0.01);而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组无明显变化。
8.相差显微镜下pcDNA-MYOC-P370L载体瞬时转染组人小梁细胞形态异常,空泡变,并有大量细胞死去。透射电镜观察到人小梁细胞细胞膜不完整、线粒体嵴断裂、线粒体肿胀、粗面内质网扩张以及脂滴和空泡增多;而pcDNA-wild-type-MYOC载体转染组人小梁细胞形态及超微结构无明显改变。
结论
1.P370L突变型Myocilin蛋白因错误折叠、构象改变而获得病理性调控功能,扰乱人小梁细胞内质网应激反应及内质网功能,改变其合成和分泌功能。
2.P370L突变型Myocilin蛋白在损伤人小梁细胞内质网功能的同时引发线粒体结构和氧化磷酸化功能的损伤,严重影响细胞生物活性,表明P370L是一种强致病性突变位点。
3.P370L突变型Myocilin真核表达载体瞬时转染人小梁细胞产生细胞毒性,引发相应病理反应,是突变型Myocilin体外研究的良好模型。
4.P370L突变型Myocilin蛋白上调糖蛋白内质网相关性降解反应,在损伤同时激发细胞保护性反应,提供治疗新靶点。
5.本研究在体外初步探讨P370L突变型Myocilin的人小梁细胞损伤机制,结果还有待于能完全模拟其自然发病过程的体内实验来进一步验证。