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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一,具有明显的地域分布特征和种族特征,我国的南部地区(广东、广西、湖南、福建等省)是鼻咽癌的高发病区之一。鼻咽癌的病因尚未完全明了,病因学与发病学的研究表明,可能的致病因素包括病毒(EB病毒)感染、遗传因素、化学致癌因素、癌基因与抑癌基因的失控等。由于鼻咽癌特殊的解剖结构和生长位置,鼻咽癌首选的治疗手段为放射治疗。近年来,伴随放射治疗设备及技术的不断革新,大大提高了鼻咽癌患者的五年生存率。而局部复发和远处转移则影响了鼻咽癌患者的预后,并限制了进一步提高患者生存率。故探讨转移相关基因在鼻咽癌转移中的作用就显得极具临床意义。KAI1基因全称Kang Ai 1基因,是Dong等1995年分离得到的特异性肿瘤转移抑制基因。该基因定位于人染色体11p11.2上,编码含有267个氨基酸的蛋白质,属于跨膜4超家族(transmembrane 4 super family, TM4SF)成员。目前TM4SF蛋白在肿瘤转移中的抑制作用已被人们所证实,主要是通过细胞膜上的广泛的糖基化作用和特异性定位,使得细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的粘附作用增强,而这些作用显著影响了肿瘤的侵袭和转移过程。多项研究表明,KAI1/CD82基因与多种肿瘤的转移和侵袭相关。血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)在胚胎发育早期即参与了血管的新生。1997年Asahara等首次从人体外周血中分离出血管内皮细胞。EPCs属于造血干细胞的一个亚群,参与血管的新生。研究发现循环中的EPCs被特异性地吸引到肿瘤微脉管系统的“热点部位”,参与到肿瘤血管生成中。EPCs可以作为很好的细胞载体,使得外源基因可以在局部器官中表达。本课题中,我们首先从蛋白及RNA水平检测了KAI1/CD82基因在人鼻咽癌组织和非肿瘤性鼻咽部组织的表达情况,并初步分析KAI1/CD82基因在鼻咽癌中的临床意义。其次,我们建立鼻咽癌荷瘤小鼠模型,应用过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染人脐静脉血分离培养的EPCs,获得高表达KAI1/CD82基因的稳转细胞(KAI1/CD82-EPCs),鼻咽癌荷瘤小鼠尾静脉注射KAI1/CD82-EPCs,观察KAI1/CD82-EPCs对肿瘤大小及肺转移的影响。通过上述研究,以期阐明KAI1/CD82在鼻咽癌侵袭转移中的作用,评价转染KAI1/CD82-EPCs在鼻咽癌防治中的应用价值。本课题主要包括以下两个方面的研究内容：第一部分KAI1/CD82基因在鼻咽癌组织中的表达与意义目的：通过免疫组织化学S-P法检测鼻咽癌和非肿瘤性鼻咽部组织的KAI1/CD82蛋白的表达情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测KAI1/CD82 mRNA的表达情况,探讨KAI1/CD82基因与患者临床病理特征的关联情况,并分析该基因与年龄、性别、临床分期、临床分型、病理类型、颈淋巴结转移之间的相关性,为提高鼻咽癌的疗效及预防肿瘤的浸润转移提供新的思路。方法：1.免疫组织化学S-P法检测142例鼻咽癌和50例非肿瘤性鼻咽部组织中。KAI1/CD82蛋白的表达情况,同时分析KAI1/CD82与临床病理相关指标的关系。2.用RT-PCR方法检测68例鼻咽癌和23例非肿瘤性鼻咽部新鲜组织KAI1/CD82 mRNA的表达情况,同时分析KAI1/CD82与临床病理相关指标的关系。结果：1.非肿瘤性鼻咽部组织KAI1/CD82蛋白的阳性表达率为70.0%(35/50),高于鼻咽癌组织中45.1%(64/142),两者差异有统计学意义(P=0.002)。2.非肿瘤性鼻咽部组织KAI1/CD82 mRNA的阳性表达率73.9%(17/23),高于鼻咽癌组织中45.6%(31/68),两者差异具有统计学意义(P=0.019)。3.鼻咽癌组织中KAI1/CD82蛋白的表达与患者的性别、年龄、病理类型、T分期等临床指标均无相关性(P>0.05),但是与淋巴结转移(N分期)相关。在无淋巴结转移(N0)的鼻咽癌患者中,KAI1/CD82蛋白的阳性表达率为75.0%(15/20)显著高于颈部有淋巴结转移(N1-3)患者的表达率40.2%(49/122),差异有统计学意义(P<0.01)。且随着N分期的进展,KAI1/CD82蛋白阳性表达率进一步降低(N0:75.0%、Ni:47.2%、N2: 40.6%、N3:27.3%)。4.鼻咽癌组织中KAI1/CD82 mRNA的表达与患者的性别、年龄、病理类型、T分期等临床指标均无相关(P>0.05),但与患者的淋巴结转移(N分期)相关。在无淋巴结转移(N0)的患者中,KAI1/CD82 mRNA的阳性表达率87.5%(7/8)高于有颈部淋巴结转移(N1-3)患者表达率40.0%(24/60),差异有统计学意义(P<0.05)。且KAI1/CD82 mRNA的阳性表达率随着N分期的进展一步步降低(N0:87.5%、Ni:50.0%、N2:40.6%、N3:20%).结论：1.KAI1/CD82基因在鼻咽癌组织中呈低表达,在非肿瘤性鼻咽部组织中高表达,提示KAI1/CD82基因可能与鼻咽癌的发生、发展相关。2.KAI1/CD82基因在鼻咽癌组织的低表达与鼻咽癌患者的淋巴结转移有关,提示KAI1/CD82基因可能在抑制鼻咽癌淋巴结转移的过程中起到一定的作用。第二部分 人鼻咽癌细胞裸鼠模型的建立及内皮祖细胞携带KAI1/CD82基因对人鼻咽癌细胞裸鼠模型肺转移的影响目的：1.阐明KAI1/CD82基因在鼻咽癌侵袭转移中的作用。2.评价转染KAI1/CD82基因的EPCs在鼻咽癌防治中的应用价值。方法：1.应用过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染血管内皮祖细胞,获得高表达KAI1/CD82基因的稳转细胞(KAI1/CD82-EPCs);2.构建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,通过裸鼠尾静脉注入KAI1/CD82-EPCs;3.观察KAI1/CD82-EPCs对裸鼠腋下移植瘤及其转移灶的影响。结果：1.将KAI1/CD82基因转染进人脐血内皮祖细胞,通过western blot的方法对转染后的内皮祖细胞进行了鉴定。2.建立了稳定的鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。3. EPCs组、EPCs-NC和KAIl/CD82-EPCs组成瘤时间分别为14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55。P=0.771,差异无统计学意义。4.EPCs组、EPCs-NC和KAI1/CD82-EPCs组移植瘤的重量分别为1.388±0.204g、1.487±0.223g、1.485±0.234g。三组数据之间差异无统计学意义(P=0.274)。5. EPCs组、EPCs-NC和KAI1/CD82-EPCs组肺转移灶生成率分别是55%、45%和10%,差异具有统计学意义(P=0.005)。三组肺脏的转移灶数目分别是34.27±5.35、38.44±9.63、17.50±3.54,差异具有统计学意义(P=0.007)。6.注射KAI1/CD82-EPCs的实验组肺转移灶免疫组织化学染色示KAI1/CD82呈阳性表达,EPCs组和EPCs-NC组肺转移灶行免疫组织化学染色,显示KAI1/CD82呈阴性表达。结论：1.本实验建立了稳定的荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。2.转染KAI1/CD82基因的EPCs对鼻咽癌裸鼠模型的肺转移具有抑制作用。