胆汁淤积性肝病由肝细胞和胆管上皮细胞损伤及胆管梗阻导致。胆汁淤积时,细胞外基质合成增加且广泛沉积在肝窦周间隙,肝内胶原纤维异常增生而导致肝纤维化,甚至发展为肝硬化。肝纤维化及肝硬化患者常合并肠道屏障功能障碍,肠道通透性改变;同时肠道微生态改变、细菌和内毒素经门静脉入血,继而激活全身炎症反应,引起多个器官功能障碍。内毒素诱导的全身炎性细胞因子增加和氧化应激又加重肠道和肝损伤,进一步促进细菌移位和内毒素血症。因此保护肠屏障对于阻止肝病进展及预防并发症至关重要。胆汁淤积性肝纤维化时,肠道胆汁酸缺如或减少可导致细菌在肠道内过度生长和菌群结构改变。一些致病性、促炎性微生物,如:紫单胞菌科和肠杆菌科过度生长,肠道通透性增加,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和细菌移位引起炎症反应,进一步加重肠屏障损害。肠黏膜屏障作为保护机体的第一道防线,可以抵抗肠腔中细菌、食物抗原、毒素等外源性物质的损伤,其中以机械屏障最为重要,其结构基础为完整的肠上皮细胞及之间的紧密连接(tight junction,TJ)。血红素在血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)的作用下可生成胆红素、一氧化碳(Carbon Monoxide,CO)及转铁蛋白。研究表明,HO-1及其产物在体内发挥重要的生理作用:抗炎、抗氧化、调控细胞凋亡等。近来研究证实,上调HO-1对于肠屏障具有保护作用。内源性CO主要依赖HO家族的生成,外源性CO来源较多,其中促一氧化碳释放分子-2(CO-releasing molecule-2,CORM-2)是一种过渡金属羰基化合物,可以不通过机体代谢而直接释放出CO。研究证实,CORM-2作为CO主要释放分子,可以保护肠上皮细胞屏障功能,同时抑制炎症细胞因子释放,促进紧密连接蛋白恢复。我们将在前期研究基础上进行深入研究,通过LPS损伤Caco-2单层细胞模型,体外实验观察钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,Co PP)内源性增加HO-1和外源性补充CO对LPS导致的Caco-2细胞肠屏障损伤具有保护作用,且主要通过减少上皮细胞凋亡、恢复紧密连接蛋白而发挥作用。同时构建慢病毒包装的HO-1过表达及敲低的稳定表达的Caco-2细胞株,从基因水平上改变HO-1表达,进一步检测HO-1对核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)及紧密连接蛋白的影响,结果证实HO-1高表达可以通过抑制TLR4/NF-κB表达,改善LPS诱导的肠紧密连接蛋白破坏和细胞凋亡。最后通过胆总管结扎建立胆汁淤积性肝损伤大鼠模型,体内实验进一步证实Co PP和CORM-2治疗对大鼠肠屏障具有保护作用。本课题采用Co PP(内源性激活HO-1)、CORM-2(外源性补充CO)及构建HO-1过表达或敲低的稳转细胞株(基因治疗)三种不同方式深入研究HO-1/CO对肝纤维化肠屏障损伤的修复作用,为今后修复肠屏障药物的研发提供实验依据。本研究共分三部分:第一部分:HO-1和CORM-2对LPS导致的Caco-2细胞损伤的修复作用。第二部分:调控HO-1基因表达对肠上皮细胞的影响及机制研究。第三部分:HO-1和CORM-2对胆汁淤积肝损伤大鼠肠道屏障功能的保护作用。第一部分HO-1和CORM-2对LPS导致的Caco-2细胞损伤的修复作用目的:肠屏障功能损伤与许多疾病的发病机制有关,包括炎症性肠病及慢性肝脏疾病等。研究表明,酒精性肝病、肝纤维化及肝硬化均存在肠屏障的破坏。肝纤维化进展过程中,肠道菌群失调、肠黏膜通透性增加,细菌及其代谢产物如LPS等经门静脉入血造成肝脏的“二次打击”,并形成“肠-肝轴”恶性循环,加重肝脏和肠道损伤,故修复肠屏障对于阻断肝纤维化进展至关重要。HO-1以及其代谢产物CO对肠屏障功能具有保护作用,本研究体外观察Co PP和CORM-2对LPS导致的Caco-2细胞损伤的修复作用。方法:本实验采用Caco-2细胞作为肠上皮屏障功能研究的体外模型。(1)首先构建Caco-2单层细胞模拟肠上皮细胞,光镜下观察Caco-2单层细胞形态,测量跨膜电阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)及胞旁漏出标记物异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐-4000(FD4)的渗透量评估Caco-2细胞单层的完整性。(2)采用不同浓度LPS刺激损伤肠上皮细胞,观察TEER的变化。(3)实时半定量q RT-PCR检测不同浓度LPS刺激后,Caco-2细胞中紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1 m RNA及蛋白的表达变化,从而筛选最佳的LPS处理浓度。(4)采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测Caco-2单层细胞上清液中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素6(interleukin6,IL-6)的水平。(5)采用不同浓度Co PP和CORM-2处理Caco-2单层细胞,CCK8检测Co PP和CORM-2的细胞毒性,同时观察不同浓度Co PP作用后HO-1及occludin m RNA的变化。依据HO-1及occludin m RNA的表达情况,选择合适的药物浓度。(6)采用Co PP(20μM,40μM)和CORM-2(50μM,100μM)预处理Caco-2单层细胞各1h,然后用LPS(10μg/m L)处理24h。TEER及FD4检测,观察Co PP和CORM-2对LPS导致的肠通透性和完整性的保护作用。(7)Western blot检测Co PP和CORM-2处理后,紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达。(8)AnnexinⅤ/PI染色检测Caco-2单层细胞凋亡,评估Co PP和CORM-2对肠上皮细胞凋亡的影响。(9)Western blot检测Co PP和CORM-2预处理对LPS导致的肠上皮细胞凋亡及细胞增殖相关蛋白(caspase 3,cleaved caspase3和PCNA)的影响。(10)ELISA检测Co PP和CORM-2预处理后,Caco-2单层细胞上清液中TNF-α和IL-6的变化。结果:(1)Caco-2细胞连续培养2周,倒置显微镜下观察细胞之间形成致密的细胞连接;Caco-2细胞单层的TEER值达到1000 Q·cm2以上;1mg/ml的FD-4在120min内的渗透量(AP-BL侧)无明显变化,一直处于较低水平(<0.5pmol/cm2),说明细胞间已形成完整的紧密连接。(2)采用不同浓度的LPS处理Caco-2单层细胞,TEER检测结果发现:和对照组相比,LPS 100μg/ml和10μg/ml的浓度下,TEER降低最明显(P<0.05)。RT-PCR和Western blot检测不同浓度LPS处理后Caco-2单层细胞紧密连接蛋白(ZO-1,occludin和claudin-1)m RNA和蛋白的表达。结果发现和对照组相比,LPS刺激可以降低ZO-1,occludin和claudin-1的表达,其中以10μg/ml时的损伤作用最明显。(3)采用不同浓度Co PP处理Caco-2单层细胞,CCK8检测结果证实5μM-100μM Co PP处理时,Caco-2细胞均未出现明显损伤,细胞数和对照组相比未见明显降低。RT-PCR检测结果证实:Co PP浓度在5μM-40μM之间时,HO-1 m RNA的表达和Co PP作用浓度呈剂量依赖式增加,当Co PP 100μM时HO-1 m RNA的表达有所下降。occludin m RNA表达在Co PP40μM时上升最明显。(4)采用不同浓度的CORM-2(10μM、50μM和100μM)处理Caco-2细胞,CCK8检测其细胞毒性。结果证实CORM-2(10μM-100μM)对细胞生长无明显抑制作用。同时我们检测了Co PP和CORM-2和LPS联合应用对Caco-2细胞生长的影响,结果证实LPS与Co PP和CORM-2联合应用对Caco-2细胞无明显损伤和抑制。(5)Co PP和CORM-2预处理可以保护Caco-2单层细胞完整性和肠通透性:TEER及FD4检测结果发现,和单独LPS刺激组相比,Co PP(20μM,40μM)和CORM-2(50μM,100μM)预处理组TEER值明显增加,FD4渗出量显著降低。(6)Western blot结果证实:单纯LPS刺激组和对照组相比,HO-1表达增加,ZO-1和occludin蛋白表达降低。Co PP(20μM,40μM)处理组HO-1的表达水平较单纯LPS刺激组显著增加,同时Co PP可以缓解LPS刺激导致的ZO-1和occludin蛋白的损伤。CORM-2处理组和LPS刺激组相比,ZO-1和occludin蛋白表达也增高。(7)ELISA结果证实,LPS刺激可以增加细胞上清液中炎症因子IL-6和TNF-α的表达水平,Co PP和CORM-2预处理组IL-6和TNF-α的表达较单纯LPS刺激组显著降低。(8)LPS刺激组肠上皮细胞凋亡较对照组明显增加,Co PP和CORM-2预处理可以减轻LPS刺激导致的肠上皮细胞凋亡,尤其以细胞早期凋亡为主,同时Western blot结果证实凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达减少,细胞增殖增加,PCNA蛋白表达较LPS刺激组显著增加。结论:Co PP可以增加HO-1的表达,上调HO-1和CORM-2通过抑制上皮细胞凋亡,阻止肠紧密连接蛋白的破坏,进而缓解LPS导致的Caco-2细胞肠上皮屏障损伤。第二部分调控HO-1基因表达对肠上皮细胞的影响及机制研究目的:研究HO-1对LPS诱导的肠上皮屏障损伤的作用及可能机制,阐明HO-1对肠上皮细胞凋亡及紧密连接蛋白的影响;初步探讨NF-κB以及特异性抑制剂在其中的作用。方法:(1)设计并合成HO-1引物,RT-PCR获取含有目的基因HO-1的c DNA片段,进行酶切及胶回收。(2)将酶切回收产物与FUGW载体连接,将产物转化感受态细胞Trans5α。(3)设计合成HO-1的sh RNA引物序列,将引物退火之后连接到PLK0.1载体,将连接产物转化到感受态细胞,之后进行涂菌。(4)每个平板上挑取3个菌落,摇菌后进行测序鉴定。鉴定正确的菌落摇菌后进行质粒抽提。(5)293T细胞内进行慢病毒的包装、收集病毒上清液,然后将携带HO-1基因及HO-1sh RNA的慢病毒转染Caco-2细胞。(6)RT-q PCR及Western blot方法检测Caco-2细胞中HO-1 m RNA及蛋白的表达,明确其过表达及敲低HO-1效果。(7)建立HO-1过表达及敲低的Caco-2细胞单层屏障模型,采用LPS损伤Caco-2单层细胞,免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、occludin的含量变化。(8)流式细胞术和Western blot检测Caco-2细胞凋亡情况。(9)RT-PCR及Western blot检测NF-κB p65的表达及活性。(10)采用NF-κB特异性抑制剂JSH-23处理Caco-2细胞,观察紧密连接蛋白、p65及p-p65的变化。结果:(1)测序结果证实:HO-1基因及HO-1shRNA被成功导入FUGW和PLK0.1载体中,之后将携带有HO基因和HO-1sh RNA的慢病毒转染至Caco-2细胞。RT-q PCR及Western blot证实,转染HO-1基因的Caco-2细胞HO-1m RNA和蛋白高表达,而转染HO-1sh RNA的Caco-2细胞HO-1m RNA和蛋白表达水平较对照组显著降低。(2)免疫荧光染色结果显示:ZO-1和claudin-1蛋白表达于细胞膜,呈蜂巢状线性分布,在细胞周围形成环状结构与周围细胞相连接。加入LPS刺激后细胞膜上claudin-1和ZO-1的荧光信号出现断裂,呈锯齿状分布,且胞浆内可见部分染色。(3)RT-PCR及Western blot结果:HO-1过表达Caco-2(HO-1组)中ZO-1和occludin的表达较对照组明显增加;HO-1敲低组(sh-HO-1组)Caco-2中ZO-1和occludin的表达较对照组显著降低。(4)免疫荧光结果示:HO-1过表达组给予LPS刺激后,紧密连接蛋白ZO-1的表达较LPS组增强,而HO-1敲低组LPS刺激对紧密连接蛋白ZO-1的破坏较对照组更显著。(5)HO-1高表达组NF-κB p65 m RNA及蛋白的表达较对照组显著降低。(6)正常Caco-2细胞给予Co PP内源性激活HO-1或者外源性补充CORM-2可以减弱LPS刺激导致的TLR4/NF-κB p65表达增加。(7)HO-1+LPS组和control+LPS组相比,细胞早期凋亡百分比显著降低;sh-HO-1+LPS组和sh-control+LPS组相比,早期凋亡细胞百分比明显增加。(8)LPS刺激时可以促进NF-κB p65核转位,而HO-1高表达可以显著抑制LPS引起的NF-κB的活化。(9)NF-κB抑制剂JSH-23可以抑制NF-κB p65的表达,同时肠紧密连接蛋白occludin的表达较单纯LPS刺激组显著增加。(10)在HO-1敲低的细胞株中,NF-κB p65和phospho-NF-κB p65蛋白的表达较HO-1高表达组显著增加,尤其是phospho-NF-κB p65蛋白的表达增高更为显著,且单纯LPS刺激可以显著增加phospho-NF-κB p65的表达,而这一效应在HO-1高表达的Caco-2单层细胞中不是很显著。结论:(1)将携带HO-1基因及HO-1sh RNA的慢病毒转染至Caco-2细胞,可成功构建HO-1高表达及敲低的Caco-2稳转细胞株。(2)HO-1高表达可明显改善LPS引起的Caco-2细胞紧密连接蛋白的表达及分布,增加ZO-1和occludin的表达;而敲低HO-1使LPS对Caco-2细胞紧密连接蛋白的破坏作用加强。(3)HO-1高表达减少LPS引起的Caco-2细胞凋亡。(4)HO-1高表达可抑制NF-κB p65的活性,同时HO-1高表达抑制磷酸化NF-κB p65的表达。(5)JSH-23可以抑制NF-κB p65且上调occludin表达。(6)正常Caco-2细胞中采用Co PP内源性激活HO-1和外源性补充CO可以减弱LPS刺激导致的TLR4/NF-κB p65表达,改善肠屏障功能。第三部分HO-1/CORM-2对胆汁淤积肝损伤大鼠肠屏障的保护作用目的:观察胆汁淤积性肝损伤大鼠肠道屏障功能的改变,并探讨Co PP内源性激活HO-1及补充CORM-2对肠屏障的保护作用。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(bile duct ligation,BDL组)、Co PP治疗组、CORM-2治疗组、锌原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)治疗组。采用胆总管结扎构建BDL大鼠模型,Co PP组、CORM-2组和Zn PP组造制模方法同BDL组,在造模2周后,分别给予腹腔注射Co PP(5mg/kg体重)、Zn PP(5mg/kg体重)和CORM-2(30mg/kg体重),隔日给药1次,共注射3次。BDL模型组腹腔注射等量的生理盐水。HE染色观察肝脏及末段回肠粘膜病理学改变,血清生化学检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransfemse,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl Transpeptidase,γ-GT)和总胆汁酸(total bile acid,TBA)水平。ELISA方法检测血清内毒素、D-乳酸及二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)活性。Western blot检测HO-1及肠紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-1)、凋亡相关蛋白(caspase3和cleaved caspase3)、PCNA、TLR4及NF-κB p65蛋白的表达。免疫组织化学染色观察末段回肠组织ZO-1、claudin-1的分布,ELISA方法检测血清TNF-α和IL-6水平。结果:(1)胆总管结扎可导致胆汁淤积,BDL大鼠血清总胆汁酸水平较假手术组显著升高,同时血清中ALT、AST、AKP及γ-GT的水平均显著增加。HE染色结果表明,BDL模型组大鼠汇管区中度纤维状增生、炎细胞浸润。(2)BDL模型组肝纤维化以2级为主,Co PP组肝纤维化以1级为主,CORM-2治疗组肝纤维化程度较BDL组明显减轻。而Zn PP组和BDL组相比,肝损伤程度无显著差别。(3)小肠病理学检测结果示:BDL组大鼠肠上皮细胞排列紊乱,小肠绒毛中断且伴粘膜脱落和广泛炎细胞浸润。Co PP组和CORM-2干预组小肠粘膜形态相对比较完整,无明显的粘膜破坏,仅表现为明显的充血、水肿和炎细胞浸润。依据Chiu’s标准对肠粘膜损伤进行评分,BDL模型组肠粘膜损伤程度明显加重(以2级和3级为主),Co PP组和CORM-2治疗组肠粘膜损伤程度较BDL组明显减轻,尤其CORM-2干预组肠粘膜损伤显著缓解。(4)ELISA结果证实,BDL模型组和假手术组相比,内毒素及DAO含量明显增高。CORM-2治疗组和BDL组相比,内毒素、D-乳酸及DAO含量均显著降低(P<0.05或P<0.01);Co PP治疗组内毒素和D-乳酸水平较BDL模型组显著降低,而DAO水平在两组之间差异无统计学意义。(5)Western blot结果显示:与假手术组相比,BDL模型组紧密连接蛋白ZO-1和claudin-1表达明显下降。Co PP组HO-1蛋白表达显著增加,且Co PP和CORM-2治疗组ZO-1和claudin-1表达较BDL模型组显著增加,差异具有统计学意义。(6)免疫组化染色结果显示:BDL组肠上皮细胞之间连接中断,claudin-1和ZO-1的染色表达相对较弱。(7)Western blot结果显示:BDL模型组caspase 3及cleaved caspase3的表达显著增加,cleaved caspase3的上调尤其显著。在Co PP和CORM-2治疗组,cleaved caspase3的表达较BDL组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),Zn PP干预组Caspase 3及cleaved caspase3的表达与BDL组之间无显著差异(P>0.05)。PCNA的表达在BDL模型组显著降低,而Co PP和CORM-2治疗组其表达较BDL组显著增加,尤以CORM-2组作用为著。(8)Western blot结果显示:和假手术组相比,BDL模型组小肠组织中TLR4及NF-κB p65的表达显著增加,Co PP和CORM-2治疗组有效减少了TLR4及NF-κB p65的上调。(9)BDL大鼠肠组织中IL-6的表达较假手术组显著增加(P<0.05),而Co PP和CORM-2治疗组和BDL组相比,IL-6的表达明显降低(P<0.05)。结论:胆汁淤积肝损伤大鼠肠道屏障功能破坏,Co PP和CORM-2可以缓解BDL大鼠肝脏和肠道损伤,并通过抑制BDL大鼠肠粘膜上皮凋亡及TLR4表达、促进肠上皮细胞增殖及改善胆汁淤积引起的大鼠肠紧密连接蛋白的破坏,从而发挥保护BDL大鼠肠粘膜屏障及抑制炎症因子释放的作用。