Ⅰ双环醇对药物性肝损伤的保护作用及机制研究　　药物性肝损伤（drug induced liver injury，DILI）是指药物在使用过程中，因药物本身或其代谢产物导致的肝脏损伤，亦称药物性肝病。近年来随着新药的不断上市及临床药物联合应用的需求，药物性肝损伤的发病率呈逐年增加的趋势。据文献报道，目前临床约40％的肝炎和25％的急性肝衰竭由药物引起，而DILI约占药物不良反应的10％-15％[1]。　　DILI的发生、发展是涉及遗传、药物种类等多因素过程，其发病机制与氧化应激、细胞因子释放、线粒体损伤、肝细胞凋亡等密切相关。目前，停药和同时给予肝保护药物是临床治疗DILI的主要手段。　　双环醇(bicyclol)是我所研制的治疗慢性肝炎的国家一类新药。临床资料显示，双环醇可明显改善慢性乙肝病人的临床症状和损伤的肝功能，且停药后反跳率低，长期应用未发现明显不良反应。以往药理研究表明，双环醇对多种化学毒物、酒精等引起的实验性急慢性肝损伤均具有较好的肝保护作用，其作用机制与其清除自由基、保护线粒体功能、抑制炎症因子过表达、抑制损伤因素导致的细胞凋亡等密切相关。　　近期临床资料表明，双环醇已用于抗精神病药、抗肿瘤药和抗结核药诱发DILI的治疗，明显改善患者受损的肝功能[2-4]，但双环醇对DILI保护作用相关机制尚不明了。本研究选用抗结核药（利福平(rifampicin，RIF)、异烟肼(isoniazid，INH)和PZA(pyrazinamide，PZA)）和阿托伐他汀引起的两种DILI模型观察双环醇的保护作用，并对相关机制进行深入探讨，为其临床应用提供科学可靠的实验依据。　　1.双环醇对抗结核药引起大鼠肝损伤的保护作用及机制研究　　大鼠灌胃给予抗结核药（RIF:200mg/kg;INH:50 mg/kg; PZA:100 mg/kg）30天可出现明显肝损伤，表现为血清丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)和总胆红素(total bilirubin，TBIL)水平升高以及肝细胞浊肿、炎细胞侵润、肝细胞坏死等病理变化。双环醇给药（50、100、200 mg/kg）可剂量依赖性显著抑制抗结核药引起的血清ALT、AST、AKP和TBIL升高，上述肝组织病理变化也得到明显改善。　　氧化应激是抗结核药肝损伤的主要诱因之一。大鼠灌胃给予抗结核药30天后，肝脏脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde，MDA)显著升高，为正常对照组的2.28倍。而非酶抗氧化物谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量显著下降，为正常对照组的32.42％。双环醇(50、100、200 mg/kg)可显著抑制肝脏MDA水平的升高，并防止GSH耗竭，使其维持在正常水平。此外，肝脏抗氧化物酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-px)活性也发生显著变化，与对照组相比分别降低51.92％、53.46％和28.89％。双环醇给药(200mg/kg)可显著抑制SOD、CAT和GSH-px活性的降低，增强机体的抗氧化能力。　　肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是介入肝损伤的重要炎症因子。抗结核药肝损伤大鼠肝脏IL-1β和TNF-α水平明显升高，分别为正常对照组的1.72和1.99倍。双环醇（100、200mg/kg）给药可明显抑制肝脏中IL-1β和TNF-α水平的升高。此外，双环醇对肝损伤大鼠血清TNF-α和IL-1β的异常升高也有明显抑制作用　　线粒体损伤尤其是线粒体呼吸链(mitoehondrial respiratory chain，MRC)功能异常在肝损伤发病过程中发挥关键作用。大鼠灌胃给予抗结核药30天后，肝脏MRCⅠ和Ⅳ活性与对照组相比分别降低38.6％和63.40％。双环醇给药（200 mg/kg）可显著增加MRCⅠ和MRCⅣ活性，使之恢复到正常水平。抗结核药肝损伤大鼠肝脏线粒体还出现对罗丹明123(rhodamine123，R123)的摄取量明显少于正常对照组，对高钙浓度诱发肿胀的敏感性显著降低，提示线粒体发生了膜渗透性转换。双环醇给药（200 mg/kg）可显著改善受损的线粒体功能。　　肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是机体抵御肝脏应激损伤的第一道防线，大鼠口服抗结核药后肝脏HGF蛋白表达明显上调，为正常对照组动物的1.4倍。双环醇给药(200 mg/kg)可进一步促进该蛋白的表达，为正常对照组动物的1.89倍。　　CYP2E1是体内参与INH代谢的细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450s)，代谢过程中产生的氧自由基被证实与INH引起大鼠和人肝损伤密切相关。此外，CYP2E1可被酒精和某些药物如RIF诱导。体外肝微粒体温孵和体内动力学研究表明，给予抗结核药30天后，大鼠肝脏CYP2E1活性和蛋白表达均明显增加。同时给予双环醇（200 mg/kg）后CYP2E1活性较模型组相比降低30.83％，并可一定程度地抑制蛋白表达水平的异常升高。　　体内动力学实验表明，大鼠灌胃给予抗结核药30天后，血浆INH的AUC0-t和Cmax与正常组大鼠相比略微下降，双环醇（200 mg/kg）给药可抑制INHAUC0-t和Cmax的降低。而双环醇给药对RIF、PZA和吡嗪酸的血浆药代动力学未见明显影响。　　此外，双环醇对三种抗结核药体外代谢影响的研究结果表明:　　1)双环醇低浓度（25μM）对RIF、INH在大鼠肝微粒体中的代谢均未见明显抑制作用，中、高浓度双环醇(50、100μM)对RIF和INH的体外代谢有不同程度的抑制作用，但该浓度明显高于药效剂量的Cmax。　　2)双环醇(25、50、100μM)对PZA在大鼠肝胞浆中的体外代谢无明显影响。　　3)双环醇(1.5、5、10μM)对RIF、PZA在人肝微粒体中的体外代谢均无明显影响。　　上述结果提示，双环醇对RIF、INH和PZA的体外代谢影响较小。　　综上所述，双环醇对抗结核药引起的大鼠肝损伤具有显著的保护作用，其肝保护机制可能与减轻氧化应激、抑制细胞因子表达、改善线粒体功能、促进HGF的表达和调控CYP2E1相关。此外，双环醇在发挥保肝作用同时，对抗结核药的体外代谢及大鼠体内血浆动力学影响较小。　　2.双环醇对阿托伐他汀引起高脂饮食金黄地鼠肝损伤的保护作用　　高脂饮食金黄地鼠每日灌胃给予阿托伐他汀（12 mg/kg）连续9天可出现明显肝损伤，表现为血清生化指标(ALT、AST和TBIL)升高以及肝组织形态学改变（肝小叶结构明显紊乱、肝束排列不齐、肝窦明显狭窄、弥漫性炎性细胞浸润、灶性坏死、大片状出血坏死）。双环醇(50、100、200 mg/kg)预防或治疗给药可剂量依赖性显著抑制阿托伐他汀引起的血清ALT、AST、AKP和TBIL升高，上述肝组织病理变化也得到明显改善。　　阿托伐他汀引起高脂饮食/肝损伤金黄地鼠还可见肝脏MDA显著升高，为正常对照组的1.47倍，而肝脏抗氧化物GSH含量明显降低，为高腊饮食对照组的44.03％。双环醇(50、100、200 mg/kg)预防及治疗给药可显著抑制肝脏MDA水平的升高，并防止GSH耗竭，使其维持在正常水平。此外，肝脏SOD、CAT和GSH-px活性也发生显著变化，与高脂饮食对照组相比，分别降低42.53％、39.03％和35.04％。双环醇（200 mg/kg）预防及治疗给药可显著抑制SOD、CAT和GSH-px活性的降低，增强机体的抗氧化能力。本研究中高脂饮食对照组动物肝脏MDA、GSH水平及SOD、CAT和GSH-px活性与标准饮食对照组相比未见明显变化。　　阿托伐他汀可引起高脂饮食/肝损伤金黄地鼠肝脏IL-1β和TNF-α水平明显升高，分别为高脂饮食对照组的8.64和4.04倍。双环醇(50、100、200 mg/kg)预防或治疗给药可明显抑制阿托伐他汀引起的肝脏TNF-α和IL-1β水平升高，并具有一定的剂量关系。此外，双环醇对血清TNF-α和IL-1β的异常升高也有明显抑制作用　　高脂饮食金黄地鼠给予阿托伐他汀9天后，肝脏MRCⅠ和Ⅳ活性与高脂饮食对照组相比分别降低41.61％和36.06％。双环醇(200 mg/kg)预防给药可显著增加MRCⅠ和MRCⅣ活性，使之恢复到正常水平。阿托伐他汀引起的高脂饮食/肝损伤金黄地鼠肝脏线粒体还出现对R123的摄取量明显减少，对高钙诱发肿胀的敏感性显著降低，提示线粒体发生了膜渗透性转换。双环醇（200mg/kg）给药后可显著改善受损的线粒体功能。　　本研究应用HepG2细胞建立了阿托伐他汀细胞损伤模型。应用此细胞模型探讨了双环醇对阿托伐他汀引起的HepG2细胞凋亡的影响。研究结果表明:　　1)阿托伐他汀(100μM)对HepG2细胞具有明显的损伤作用，细胞存活率下降为对照组的48.7％，显微镜下可见细胞出现皱缩、细胞核膨胀等形态学改变。双环醇(1、50、100μM)可显著抑制阿托伐他汀引起的细胞存活率下降，并呈一定的量效关系，细胞形态学改变也明显减轻。　　2)阿托伐他汀(100μM)可引起HepG2细胞中参与细胞凋亡最主要的终末剪切酶Caspase-3/7活性明显升高，为正常对照组的1.51倍。双环醇（100μM）可显著抑制阿托伐他汀引起的细胞Caspase-3/7活性的异常升高。　　3)细胞线粒体膜电位检测和AO-EB双荧光细胞核染色实验结果表明，阿托伐他(100μM)）处理HepG2细胞后，细胞发生早期凋亡。双环醇(100μM)可明显抑制阿托伐他汀引起HepG2细胞的凋亡。　　4)阿托伐他汀给药后，细胞浆内无活性的RhoA蛋白表达量显著升高，为正常对照的1.86倍，双环醇(100μM)可显著抑制RhoA蛋白的表达上调，使其表达水平趋于正常。此外，本研究可见HepG2细胞经阿托伐他汀(100μM)处理后，RhoA活性下降至正常细胞的48.46％。双环醇(100μM)对阿托伐他汀引起的细胞RhoA活性的下降具有明显的保护作用。　　由此可见，双环醇对阿托伐他汀引起的高脂饮食金黄地鼠肝损伤和HepG2细胞损伤具有良好的保护作用。双环醇的保护作用机制与减轻氧化/硝化应激、抑制细胞因子表达、改善线粒体功能、调控RhoA功能和抑制细胞凋亡相关。　　综上所述，双环醇对抗结核药(RIF、INH和PZA)和阿托伐他汀引起的DILI具有明显的保护作用。其不仅可抑制血清转氨酶、AKP和TBIL的升高、还可改善肝脏病理学损伤，其保护作用的机制可归纳为:　　1.代谢酶调控:抑制CYP2E1活性并下调其蛋白的异常表达。　　2.改善氧化应激:抑制脂质过氧化，恢复GSH含量，改善抗氧化物酶SOD、GSH-px、CAT的活性。　　3.改善硝化应激:抑制NO升高及iNOS/TNOS蛋白的过表达。　　4.抑制炎症细胞因子表达:下调血清和肝脏TNF-α、IL-1β蛋白的过表达。　　5.减轻线粒体损伤:维持线粒体膜完整性和正常膜电位，增加MRCⅠ和Ⅳ活性。　　6.调节凋亡和肝保护相关蛋白:提高细胞RhoA活性和促进肝脏HGF的表达。　　上述研究为进一步了解双环醇的肝保护作用特点以及临床治疗DILI提供了有参考价值的实验依据。　　Ⅱ抗HIV新化合物F18的代谢产物-M3与UGTs同工酶的相互作用　　F18是基于天然产物化学修饰的新型非核苷类抗HIV化合物。药效学研究表明，其体外抗HIV活性及治疗指数均比天然产物高10倍。F18与已上市药物奈韦拉平的抗HIV活性相当，并具有较好的协同作用，尤其是对临床主要耐药病毒株Y181C（对耐韦拉平等药物不敏感）也具有明显抑制作用，EC50小于1nM。急性毒性实验表明，该化合物毒性较低。因此，F18有望成为临床治疗艾滋病的新药。　　前期药代研究结果表明，大鼠和人肝微粒体中可检出4个F18的Ⅰ相代谢产物，其中氧化脱氯产物M3为主要的Ⅰ相代谢产物。大鼠口服F18后，代谢产物M3可进一步经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP glucuronosyltransferase，UGTs）催化生成葡萄糖醛酸结合物，但介入M3Ⅱ相代谢的UGTs类型及M3对UGTs的影响尚不明了。因此，本研究应用人肝微粒体和重组人源UGTs同工酶体外温孵体系，选择UGTs同工酶探针底物和抑制剂，鉴定了参与M3Ⅱ相代谢的UGTs同工酶类型，评价了M3对UGTs活性的体外抑制作用，并进一步探讨了M3与UGTs底物药物（MPA和AZT）的体外相互作用。实验结果表明:　　1)在人肝微粒体和6个重组人源UGTs同工酶中，UGT1A1是参与M3Ⅱ相结合反应的主要同工酶，UGT1A4、1A9和2B7部分参与。　　2) M3(10、100μM)可显著抑制人肝微粒UGT1A9和2B7的活性(P＜0.01)，M3（100μM）对人肝微粒体UGT1A1和1A4也有一定抑制作用，抑制率分别为23.9％和17.5％。在人源重组酶中，M3(10、100μM)对UGT1 A9和2B7的抑制作用较人微粒体中更为显著，对UGT1A3和1A6未见明显的抑制作用。　　3) M3以混合性方式抑制人肝微粒体UGT1A9介导的霉酚酸(mycophenolicacid，MPA)Ⅱ相葡萄糖醛酸化反应，IC50值为0.39±0.06μM(BSA+)和0.58±0.14μM(BSA-)，Ki值为16.60±2.31μM(BSA-)和1.19±0.26μM(BSA+)。MPA对M3在人肝微粒体中的葡萄糖醛酸化反应未见明显影响。　　4)体外人肝微粒体研究可见，M3和齐多夫定(zidovudine，AZT)以混合性方式相互抑制，M3对AZT的抑制常数Ki为16.81±1.22μM，AZT对M3的抑制常数Ki为902.0±21.1μM。　　综上所述，UGT1A1是参与M3Ⅱ相葡萄糖醛酸结合反应的主要同工酶。M3体外对UGT1A9和2B7具有较强的抑制作用。M3对UGT1A9介导的MPA代谢和UGT2B7介导的AZT代谢具有抑制作用。上述结果为研究临床M3引起药物相互作用的潜在可能提供了一定的参考依据。