论文部分内容阅读
甘遂(Euphorbia kansui Liou)是大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)的多年生草本植物,是我国特有的一种传统中药,入药部位为其块根,主治水肿、咳喘、肿瘤等病症。每年7、8月份幼苗由种子或留在地下的块根形成,12月份生长停止,完成营养生长,到次年3月份幼苗出土,4月份开花,5月底果实成熟,完成生殖生长。甘遂全株各部位均有白色乳汁,其为乳汁管的细胞质。甘遂的乳汁管为无节分枝乳汁管,其有效成分如萜类和类黄酮等物质大多产生并储存于乳汁中,因此研究乳汁管的发育具有很重要的理论和实践意义。细胞自噬是一种高度保守的物质循环过程,主要是调控长寿命蛋白质和功能异常的细胞器的降解。我们课题组在甘遂的乳汁管中观察到线粒体、质体等细胞器与类似溶酶体的小型酸性细胞器融合的现象,并在甘遂转录组数据中发现了自噬相关基因。基于此,我们根据甘遂转录组信息克隆了自噬相关蛋白ATG8家族的2个同源基因(ATG8c和ATG8f)的CDS序列,并分析了其在根、茎、叶和乳汁中的表达,同时建立了甘遂快繁生芽和生根以及愈伤组织培养的最佳条件,为后续甘遂乳汁管自噬发生模式、构建ATG8转基因体系及深入研究乳汁管自噬发生机理奠定基础。研究结果如下:(1)ATG8c的编码序列(CDS)为381 bp,编码126个氨基酸,预测其蛋白分子质量为14.53 kDa,理论等电点(pI)为7.89;ATG8f的CDS为369 bp,编码122个氨基酸,预测其蛋白分子质量为14.08 kDa,pI为7.85。同源比对与进化树证明2个基因保守性很高。通过表达模式的分析发现,ATG8f的表达量在根、茎、叶和乳汁中均比ATG8c高,其中ATG8f在叶中的表达量最高,ATG8c在乳汁中最高。(2)甘遂外植体消毒:将植物园采集的叶片或茎段清洗干净,70%乙醇浸泡10 s后,无菌水洗2次,接着0.08%升汞消毒:叶片消毒5 min,茎段消毒8 min,无菌水洗5遍。(3)茎段(无腋芽)和叶片均用MS+6-BA 2.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L为愈伤诱导的最佳培养基,诱导率分别是60.88%和45.33%;以带有腋芽的幼嫩茎段为外植体,诱导丛生芽,最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 3.0 mg/L,诱导率为89.46%,增殖系数为8.93;壮苗培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,诱导率为89.39%;最后较粗壮的苗在1/2MS+IBA 0.5 mg/L或1/2MS+IBA 1.0 mg/L培养基中诱导生根,生根率分别是28.15%和35.01%,增殖系数分别为3.75和1.53。