论文部分内容阅读
本研究以银杏内酯B(Ginkgolide B)为研究对象,以血管内皮细胞内的孕烷X受体(pregnane X receptor, PXR)为靶点,研究银杏内酯B是否能够激活PXR并产生对血管内皮细胞的保护作用及其相关分子机制。利用本实验室建立的基于分泌型Gaussia荧光素酶报告基因pGLuc-Basic系统PXR-CYP3A4通路的药物相互作用快速筛选平台,发现银杏叶提取物中银杏内酯B对PXR具有潜在的激活作用。为进一步验证筛选结果,将PXR调控的靶基因CYP3A4(cytochrome P450 3A4, CYP3A4)作为指标,考察银杏内酯B激活PXR后是否对CYP3A4产生诱导作用。以内源性PXR表达丰富的LS174T细胞作为研究细胞载体,通过siRNA/PXR干扰技术,实时定量PCR和Western Blot技术检测PXR被敲低前后,银杏内酯B对相关靶基因调控的变化差异,以确证筛选结果的可靠性,为进一步药理效应和机制研究提供实验数据支撑。在确认银杏内酯B为PXR激动剂后,进一步对其激活PXR后血管内皮保护作用及机制进行了研究,选取人脐静脉内皮细胞’human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)给予不同浓度的银杏内酯B和阳性药利福平(Rifampicin, RIF)进行处理。利用Realtime-PCR和Western Blot技术以及siRNA/PXR干扰技术,流式细胞仪和荧光显微镜等检测细胞凋亡和细胞存活率,同时检测PXR基因所调控的下游相关基因CYP3A4和多药耐药基因(multidrug resistancel,MDR1)的mRNA表达水平、细胞凋亡相关蛋白质Caspase3/PreCaspase3蛋白比例、通过流式细胞仪检测的细胞凋亡结果和炎症反应相关的E-选择素(E-selectin)和血管粘附反应因子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)在mRNA表达水平和蛋白质水平的变化。并通过粘附实验考察银杏内酯B激活PXR后对E-选择素(E-selectin)和血管粘附反应因子(vascular cell adhesion moleculel,VCAM-1)表达的改变对人急性白血病单核细胞株(THP-1)的黏附能力的影响。结果显示：1)银杏内酯B对LS174T细胞CYP3A4表达的影响,结果显示银杏内酯B浓度依赖性上调CYP3A4基因及蛋白表达,提示银杏内酯B对CYP3A4确有诱导效应；在利用siRNA敲低PXR表达的条件下,银杏内酯B对CYP3A4诱导作用明显低于PXR未敲低组,进一步表明PXR参与银杏内酯B对CYP3A4表达的诱导效应,同时银杏内酯B对PXR表达无明显影响。2)进一步实验显示银杏内酯B对人脐静脉细胞中CYP3A4和MDR1的mRNA表达同样具有诱导作用,Western blot检测结果显示银杏内酯B对PXR蛋白的表达没有明显的诱导作用；PXR的核内迁移实验显示银杏内酯B能明显促进PXR由细胞浆向细胞核的迁移,细胞核内PXR量随着银杏内酯B浓度增加而增加。3)流式细胞检测显示银杏内酯B有效降低ST引起的HUVECs田胞凋亡,当PXR被敲低后,银杏内酯B抑制ST引起的HUVECs细胞凋亡作用被明显削弱,提示银杏内酯B通过激活PXR受体能够显著地抑制细胞凋亡。4)银杏内酯B能显著逆转TNF-a所致E-selectin和VCAM-1上调和细胞粘附增加。PXR被敲低后这种逆转效应消失,提示银杏内酯B通过激活PXR受体降低炎症相关分子表达,从而降低血管内皮细胞病理状态下炎症反应的发生,进而发挥血管内皮细胞的保护作用。综上所述,银杏内酯B通过激活PXR受体上调其调控的靶基因如CYP3A4和MDR1的表达；通过激活PXR受体抑制血管内皮细胞的凋亡和降低炎症反应保护血管内皮细胞对抗外源性物质的损害,可能是银杏内酯B血管内皮细胞的保护机制之一。同时银杏内酯B对CYP3A4诱导具备发生药物相互作用的潜在风险,临床联合用药时应给予关注。