枯草芽孢杆菌在环境中分布广泛,主要应用于食品、农业及环保等领域。作为酱香功能菌株生产的产品如酱油、豆酱、豆豉、白酒等酱香类食品都深受消费者们的喜爱,迄今为止,枯草芽孢杆菌产酱香的机制仍然不清。通过对工业生产菌株B.subtilis BJ3-2进行中高温(45℃)和中温(37℃)的转录组进行测序,对其差异性进行了富集分析,筛选得到多个基因,最后通过生物信息学分析筛选得到3个基因可能与酱香相关,对其敲除后进行酱香功能研究。取得的结果如下:1、通过前期转录组数据,对其表达量分析、差异基因的GO分析KEGG注释和富集分析,控制筛选条件Fold-change≧2与FDR≦0.05,在45℃高表达的基因,初步筛选出15个差异显著基因,对其进行综合分析,获得出3个产酱香候选基因,cdoA(半胱氨酸双加氧酶)、panE(酮泛解酸还原酶)、lspA(脂蛋白信号肽酶Ⅱ)。2、荧光定量PCR对B.subtilis BJ3-2在37℃和45℃培养条件下的3个候选基因cdoA、panE、lspA的表达量进行检测,以16S rRNA作为内参基因。结果显示,cdoA、panE和lspA在45℃比37℃的表达量分别增加1.81、1.38、和1.51倍,与转录组结果一致,最后对其进行产酱香功能研究。3、构建cdoA、panE和lspA同源重组双交换敲除载体,pUC18+HLarm+cat+HRarm同源载体。以pUC18为载体,分别设计并合成带酶切位点的特异性引物,PCR扩增BJ3-2基因组获得相应基因的同源左臂(HLarm)和同源右臂(HRarm),同时以pHT01cas9-p43载体为模板扩增出的氯霉素基因(cat),连接并转化至E.coli DH5α,通过菌落PCR、质粒PCR、双酶检测和测序验证,最终分别获得3个目的基因的同源重组双交换敲除载体pUC18+HLarm+cat+HRarm。4、将3个双交换敲除载体利用化学法转化至B.subtilisBJ3-2中,并通过革兰氏染色、PCR验证和质粒测序验证,获得BJ3-2△cdo A,BJ3-2△panE和BJ3-2△lspA基因敲除菌株。5、将3株敲除菌株分别接种大豆于45℃发酵72h获得豆豉,相对原始菌株,BJ3-2△cdoA发酵的豆豉色泽变浅,酱香味降低;BJ3-2△panE发酵的豆豉色泽变化不显著,但粘性增强,酱香味降低;BJ3-2△lspA发酵的豆豉色泽则最浅,粘性显著增强,粘丝较多且明亮,酱香味显著减弱。通过顶空微萃取后GC-MS检测豆豉挥发性物质结果显示,BJ3-2△cdoA、BJ3-2△panE和BJ3-2△lspA发酵的豆豉中2.3丁二醇的含量较对照分别降低了0.437%、0.108%和0.474%,乙偶姻的含量较对照分别降低了5.415%、6.259%和1.101%,四甲基吡嗪的含量较对照分别降低了0.768%、0.025%和4.063%。综上所述,3个基因分别通过氨基酸、泛酸和CoA的生物合成以及糖蛋白的运输,最终作用于丙酮酸途径,从而影响奖项风味物质四甲基吡嗪。通常认为酱香与食物的褐化程度呈正相关,敲除cdoA、lspA基因后豆豉酱香味减弱褐化程度减弱,但敲除panE基因后豆豉酱香味减弱褐化程度不变,说明酱香与豆豉褐化程度并不一定呈线性相关。