多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种革兰阴性菌,能在哺乳动物、禽类和人类中引起多种疾病。多杀性巴氏杆菌能分为5种荚膜血清型（A、B、D、E、F）和16种脂多糖血清型。不同血清型往往与宿主嗜性等有一定关联;同一血清型之间,不同的多杀性巴氏杆菌分离株在毒力上也可能存在着很大的差异。A型多杀性巴氏杆菌通常存在于上呼吸道,与动物呼吸系统疾病密切相关。目前,关于多杀性巴氏杆菌的致病机制及诱导宿主的免疫反应机制等尚不十分清楚。炎症小体（Inflammasome）是细胞质中多种蛋白组装成的复合物,在宿主抗病原体感染和调控炎症反应中起重要作用。其中NLRP3炎症小体研究的最为广泛,NLRP3受体分子能感知多种刺激,然后与ASC、pro-caspase-1一起组装为炎症小体复合体,并激活caspase-1。pro-IL-1β能被激活的caspase-1切割为成熟的IL-1β,并随后分泌至胞外。本研究用多杀性巴氏杆菌感染小鼠体内外模型,研究A型多杀性巴氏杆菌强毒株PmCQ2和弱毒株PmCQ6诱导宿主炎症反应的差异。采用ELISA、RT-PCR和Western blot检测炎症细胞因子IL-1β的转录、成熟与分泌,透射电镜（TEM）检测多杀性巴氏杆菌的结构,主要探究:（1）强毒株PmCQ2和弱毒株PmCQ6诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应差异;（2）PmCQ2和PmCQ6引起IL-1β的转录是否有差异以及哪些信号通路参与其中;（3）何种炎症小体参与了IL-1β的产生;（4）细胞的吞噬作用对IL-1β分泌的影响;（5）细菌的荚膜厚度对IL-1β的产生是否有影响;（6）PmCQ2和PmCQ6诱导宿主炎症反应是否存在差异。结果具体如下:1.PmCQ2和PmCQ6诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β的分泌存在差异本研究通过细菌形态观察发现,两株牛源A型多杀性巴氏杆菌PmCQ2和PmCQ6形态存在很大的差异。然后,分别用1×10⁵ CFU的细菌滴鼻感染小鼠,检测这两株菌对小鼠的致病性。结果显示,PmCQ2感染组小鼠6 d以内全部死亡,而PBS和PmCQ6感染组全部存活,说明两株菌的毒力存在着很大的差异。为进一步检测诱导的炎症反应差异,分别用1 MOI的PmCQ2、PmCQ6感染小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的分泌。结果显示,PmCQ6感染组中IL-1β的分泌显著高于PmCQ2感染组,而两者诱导IL-6、TNF-α和IL-12p40的分泌无显著性差异,提示PmCQ2和PmCQ6诱导炎症细胞因子IL-1β分泌的机制不同。2.TLR2参与PmCQ2和PmCQ6诱导IL-1β产生为探索TLR2和TLR4是否参与了IL-1β产生的过程,本研究通过RT-PCR检测PmCQ2和PmCQ6感染巨噬细胞9 h后TLR2和TLR4的表达,结果显示,PmCQ2和PmCQ6感染能诱导巨噬细胞中TLR2的表达显著上调,而不引起TLR4的表达上调,表明TLR2介导的信号通路参与了IL-1β的产生过程。3.p38信号通路在PmCQ2和PmCQ6感染中有不同的调控作用为进一步研究哪些信号通路参与IL-1β的产生过程,本研究采用几种重要的炎症通路信号抑制剂分别处理巨噬细胞1 h,再用1 MOI的PmCQ2、PmCQ6活菌或灭活菌感染,ELISA和western blot检测IL-1β的合成与分泌。结果显示,NF-κB、PI3K、Syk和caspase-1信号通路抑制剂处理巨噬细胞后,IL-1β的分泌水平显著下降,说明这些信号通路都参与了IL-1β的分泌。与未处理的感染组相比,在p38信号通路抑制剂处理组中,PmCQ6诱导IL-1β的分泌水平显著下降,而PmCQ2感染组对IL-1β的分泌无影响,表明p38信号通路仅参与了在PmCQ6诱导的IL-1β的分泌过程。4.PmCQ2和PmCQ6诱导相似水平的IL-1β前体表达为确定PmCQ2和PmCQ6感染后,两者诱导IL-1β的转录水平是否存在差异,通过RT-PCR检测感染巨噬细胞9 h后IL-1β的mRNA表达。结果显示,PmCQ2和PmCQ6感染巨噬细胞后均能诱导IL-1β的转录显著上调,但两者诱导IL-1β的转录水平无显著性差异,表明PmCQ2和PmCQ6诱导IL-1β的差异并非体现在转录水平,而在其成熟与分泌这一过程。5.NLRP3炎症小体参与IL-1β的成熟与分泌为确定哪种炎症小体参与PmCQ2和PmCQ6感染诱导的IL-1β成熟与分泌,用1 MOI的PmCQ2、PmCQ6感染WT、caspase1^-/-、Asc^-/-、Nlrp3^-/-、Nlrc4^-/-和Aim2^-/-小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测IL-1β的分泌,同时检测IL-6的分泌水平作为对照。结果显示,与WT相比,caspase1^-/-、Asc^-/-、Nlrp3^-/-中IL-1β的分泌显著下降,Nlrc4^-/-和Aim2^-/-中IL-1β的分泌与WT无显著性差异。同时,在6种小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6的分泌水平无显著性差异。结果表明,NLRP3炎症小体参与了IL-1β的分泌。为进一步探索NLRP3的参与程度,用RT-PCR方法检测了Nlrp3基因的表达,并用western blot检测caspase-1的激活水平。结果显示,PmCQ2和PmCQ6感染巨噬细胞9 h后能显著诱导Nlrp3基因的表达,并且PmCQ6诱导Nlrp3基因的表达水平和caspase-1激活水平显著高于PmCQ2,表明NLRP3炎症小体在PmCQ6感染中激活程度更强。6.细胞的吞噬作用参与IL-1β产生的信号通路NLRP3受体分子是一种胞内PRR,Pm是如何将其激活从而诱导IL-1β的产生。为研究细胞吞噬作用与IL-1β产生的关系,用1 MOI的PmCQ2、PmCQ6感染小鼠腹腔巨噬细胞,对黏附和入侵巨噬细胞的细菌进行平板计数。结果显示,PmCQ6入侵/黏附的比例显著高于PmCQ2的比例,表明PmCQ2、PmCQ6可能通过吞噬作用进入细胞引起NLRP3炎症小体组装。同时,用Cyto.B处理细胞后,PmCQ2、PmCQ6诱导IL-1β的分泌水平降低。此外,用1 MOI灭活的PmCQ2、PmCQ6感染小鼠腹腔巨噬细胞,ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。研究发现PmCQ2、PmCQ6灭活后,两者诱导IL-1β的分泌无显著性差异。而根据前面的研究发现活菌诱导IL-1β的分泌存在差异,表明细胞吞噬参与了炎症信号通路的激活。7.荚膜厚度对IL-1β的产生有影响为确定何种因素导致PmCQ2、PmCQ6黏附进入细胞的差异,本研究将两株菌培养至10⁸ CFU-10⁹ CFU之后,用透射电镜检测两株菌的荚膜。结果显示,PmCQ2菌体的荚膜非常厚,而PmCQ6的菌体外仅有少量的荚膜。推测可能是由于荚膜影响细菌黏附和抗吞噬作用,从而导致NLRP3炎症小体激活以及IL-1β分泌的差异。为验证这一猜想,采用终浓度为100 U的透明质酸酶处理细菌以减少其荚膜厚度,再感染巨噬细胞,收集上清用ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌情况。结果显示,PmCQ2、PmCQ6处理组中的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌均显著性降低。表明荚膜的厚度对细胞因子的产生有一定的影响。8.PmCQ2和PmCQ6诱导宿主炎症反应存在差异为研究PmCQ2和PmCQ6诱导宿主炎症反应差异,本研究用1×10⁵ CFU PmCQ2和PmCQ6分别滴鼻感染小鼠,HE染色测定肺组织病理变化。结果表明,在PmCQ2感染后,小鼠肺脏有大量炎性细胞浸润,而PmCQ6感染肺部只有轻微的炎症反应。为进一步检测炎症反应的水平,分别用PmCQ2和PmCQ6 1×10⁵ CFU感染小鼠,采集支气管肺泡灌洗液和外周血清,ELISA检测炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。结果表明,BALF中,PmCQ2诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌水平显著高于PmCQ6。然而,外周血清中,PmCQ2和PmCQ6诱导这些炎症细胞因子的分泌量很低,与对照组比较无显著差异。说明这两种菌株引起宿主的炎症反应存在差异,并且靶器官的炎症反应更明显。为研究这种差异的原因,采用PmCQ2、PmCQ6滴鼻感染小鼠,通过将小鼠肺组织的菌落进行计数,检测小鼠肺脏中细菌的定殖情况。结果显示PmCQ2在小鼠肺脏进行了大量的增殖,而PmCQ6感染组小鼠肺脏中则未检测到细菌的定殖。表明可能是细菌定殖能力差异的原因导致PmCQ2和PmCQ6诱导宿主炎症反应的差异。体外细胞水平,说明弱毒株由于荚膜较薄,更易被巨噬细胞吞噬,导致引起的炎症因子水平更高,并解析了相关信号通路,这种现象的意义可能是导致宿主清除弱毒株;体内感染时,强毒株由于荚膜更厚等原因,定殖和抗吞噬能力更强,引起强烈的炎症反应剧烈,对动物致死率也高。