人ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本课题组用消减杂交法从人脑内克隆得到的一个抑癌候选基因,已被Gen Bank收录,登录号为AF159092。它定位于染色体14q11.2,mRNA全长2024bp,编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约为40kDa的蛋白质。ndrg2为ndrg基因家族成员之一,该家族成员有4个:ndrg1, ndrg2, ndrg3, ndrg4,且该基因家族成员的氨基酸组成在从低等生物到高等生物的进化中有相当高的保守性,以上提示该基因家族在细胞的生命过程起着重要作用。本课题组初步研究结果显示,该基因在多种正常组织中高表达,而在某些肿瘤组织和肿瘤细胞系中低表达或无表达,比如发现该基因在肺癌和肝癌中的表达明显低于相应的癌旁组织,还发现该基因在体外可抑制多种肿瘤细胞系的生长,如瞬时转染胶质瘤细胞系BT325具有抑制细胞增殖的功能,推测该基因可能与肿瘤的发生发展有关,因此提出ndrg2可能为新的候选抑癌基因。但其作用的具体机制尚不清楚。为了深入研究ndrg2基因的功能,阐明其在体内的作用机制,弄清具体的信号传导通路及其如何与其他分子相互作用。本课题组拟建立稳定转染抑癌候选基因ndrg2的脑胶质瘤细胞系并进行细胞生物学检测,今后进一步对该基因进行深入研究。首先,通过RT-PCR检测方法检测几种常见的肿瘤细胞(肺癌细胞A549、人胚肾细胞293、乳腺癌细胞sk-br-3、结肠癌细胞HT29、人脑胶质瘤细胞U251、U87以及胃癌细胞SGC-7901等细胞株),比较其ndrg2表达含量的差异,结果发现在不同肿瘤细胞系中ndrg2 mRNA表达含量大不相同,在人胚肾细胞293中有较高的表达,在A549、HT-29、U251、7901细胞中低表达,在sk-br-3和U87细胞中没有检测到ndrg2的表达。考虑到U251细胞系为较常见的胶质瘤细胞系,其ndrg2表达量低,选用U251作为本次实验稳定转染的靶细胞。本实验用已构建好的质粒pEGFP-c2-ndrg2转染U251细胞系,经G418进行筛选后,挑取单克隆进行培养。之后,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、western印迹等方法验证获得的表达细胞株是否过表达ndrg2。经上述方法验证无误后,初步认为转染是成功的,本课题组首次建立了稳定转染ndrg2的胶质瘤细胞系。外源性基因ndrg2在胶质瘤细胞中的稳定表达会对细胞有哪些影响呢?为了解决这一问题,本次试验还采用流式细胞术、MTT法、平板克隆形成试验对稳定转染后胶质瘤细胞U251的性状进行了检测。稳定转染ndrg2后的U251处于G1期细胞数为73.2%,明显高于转染空载体的U251 G1期细胞数(47.5%),说明稳定转染后的U251细胞增殖能力明显下降,大多数细胞处于G1期,DNA合成期细胞减少。同样,MTT法和平板克隆形成试验的结果也分别表明稳定转染ndrg2后的细胞生长能力下降,克隆形成能力有所降低。由此可见,外源性基因ndrg2的稳定表达对胶质瘤细胞起到了一种抑制作用。本实验首次建立了稳定转染ndrg2的脑胶质瘤细胞系U251,同时对外源性ndrg2基因在胶质瘤细胞中的稳定表达进行细胞生物学检测,发现转染后的胶质瘤细胞在增殖速度、生长能力以及克隆形成能力等方面都较前有所降低,认为ndrg2基因对胶质瘤细胞具有抑制作用,这也与之前本课题组在瞬时转染胶质瘤细胞系所得的结果相一致,进一步验证了ndrg2是一种抑癌基因的理论。关于ndrg2在体内的信号传导途径及其如何发挥作用,本课题组将进行进一步的探索。