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研究背景单纯疱疹病毒性角膜炎(Herpes simplex keratitis,HSK)是国内外最常见的致盲性眼病之一,主要由I型单纯疱疹病毒引起,如果得不到及时有效的治疗容易导致角膜基质混浊、角膜瘢痕形成、角膜溃疡穿孔,甚至导致失明、眼球丧失等严重并发症。HSK的特点是有免疫因素参与、病程长、病情重且容易迁延和反复发作。HSK的病理损害主要是由于病毒感染导致的角膜持续性免疫反应,多种炎症细胞如多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)、T淋巴细胞和巨噬细胞等均参与其中。目前认为,HSK角膜基质的持续性炎症和T淋巴细胞的异常活化和聚集密切相关,CD4+T淋巴细胞在炎症部位的持续存在与HSK迁延反复的病程密切相关。因此,调控HSK角膜组织内免疫细胞的定向迁移对探索新的HSK治疗方法具有重要的价值。SHIP-1(SH2-containing inositol 5’-phosphatase 1)是含有SH2结构的5’肌醇磷酸酶-1,能够水解磷脂酰肌醇激酶(PI3K)信号途径中的关键物质磷脂酰肌醇三磷酸(PI(3,4,5)P3),而PI3K信号通路又显著影响了细胞的增殖、分化,迁徙和凋亡,表明了SHIP-1对T淋巴细胞发育,分化和稳态的巨大调控潜能。研究发现,SHIP-1磷酸化可以负向调节PI3K信号通路,进而阻碍趋化因子11(CXCL11)对T淋巴细胞的趋化作用,限制T淋巴细胞向病变部位的迁移,这对于肿瘤病程中出现的免疫逃逸有重要意义。趋化因子受体CCR7是T淋巴细胞向次级淋巴器官稳态转运的最重要的介质之一,其与配体趋化因子19和21(CCL19、21)的结合介导了T淋巴细胞跨内皮微静脉进入次级淋巴器官的跨内皮迁移,显著影响淋巴细胞从外周炎症部位迁出及淋巴细胞归巢运动。然而,SHIP-1是否会调控CCL19、21-CCR7趋化系统介导的CD4+T淋巴细胞在炎症部位的迁出作用,目前尚未明确。同时,在HSK临床患者中,其病变角膜浸润的CD4+T淋巴细胞是否表达SHIP-1,以及其表达是否与HSK病情严重程度相关,目前仍不得而知。因此,本研究主要侧重于观察SHIP-1对CCL19、21-CCR7趋化系统介导的CD4+T淋巴细胞迁移运动的影响及其机制,以及HSK患者病变角膜中CD4+T淋巴细胞及SHIP-1表达情况,并分析其表达与HSK病情严重程度的关系。研究目的探究CD4+T淋巴细胞中SHIP-1表达水平对CCL19、21介导的CD4+T淋巴细胞迁移作用的影响及其机制,并分析HSK患者病变角膜中浸润CD4+T淋巴细胞及SHIP-1表达情况及其与HSK病情的关系。研究方法分离培养激活状态的原代CD4+T淋巴细胞,采用24孔Transwell系统分析不同浓度SHIP-1激动剂及拮抗剂处理CD4+T淋巴细胞后,T淋巴细胞向趋化因子19、21迁移能力的改变。采用Ibi Di2D趋化系统和活细胞成像技术进一步观察比较SHIP-1激动或拮抗后,CCL19、21介导的CD4+T淋巴细胞迁移速度及距离的差异。使用蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测不同处理后T淋巴细胞表面CCR7表达差异。使用蛋白质印迹法明确实验过程中不同处理下细胞趋化能力改变与PI3K-PI(3,4,5)P3-Akt-NF-κB信号通路以及转录因子KLF2表达之间的关系。实验中数据统计分析采用Graph Pad Prism 6.0软件和SPSS 24.0软件。免疫荧光染色观察角膜白斑和HSK稳定期和炎症期患者角膜移植后取下的病变角膜中浸润CD4+T淋巴细胞及SHIP-1表达情况,探究CD4+T淋巴细胞浸润及SHIP-1表达情况与HSK病情的关系。结果1.24孔Transwell和Ibi Di2D趋化活细胞成像系统显示SHIP-1拮抗(10、30n M)可以显著抑制CCL19、21介导的CD4+T淋巴细胞迁移,而SHIP-1激动剂(30n M)则对该定向迁移产生促进作用。免疫印迹法测量细胞内CCR7蛋白表达水平发现,SHIP-1拮抗剂处理后细胞内CCR7蛋白表达下降,激动剂处理组则与此相反。细胞爬片免疫荧光染色显示,SHIP-1拮抗剂处理的细胞,其表面趋化因子受体CCR7出现内化磷酸化,而SHIP-1激动剂可以引起CCR7在细胞表面的明显趋向性分布。2.免疫印迹法检测不同浓度SHIP-1激动剂和拮抗剂处理后CD4+T淋巴细胞中转录因子KLF2,PI(3,4,5)P3,磷酸化Akt和磷酸化NF-ΚB蛋白表达发现,用SHIP-1激动剂处理后CD4+T淋巴细胞中KLF2表达增加,PI(3,4,5)P3,磷酸化Akt和磷酸化NF-ΚB减少,而拮抗剂组CD4+T淋巴细胞中KLF2表达减少,PI(3,4,5)P3,磷酸化Akt和磷酸化NF-ΚB活化增加。3.免疫荧光染色显示,炎症期HSK患者离体角膜组织内存在明显SHIP-1和CD4+T淋巴细胞共染现象,而角膜白斑和稳定期HSK患者无明显共染现象。结论1.激动CD4+T淋巴细胞中SHIP-1表达,可以通过增强趋化因子受体CCR7表达,进而促进CCL19、21-CCR7介导的T淋巴细胞从外周或炎症部位向局部淋巴结的转移,而拮抗细胞内SHIP-1表达,可以抑制此迁移过程。2.SHIP-1对CCR7介导的T淋巴细胞向CCL19、21迁移过程的调控与其负向调节PI3K-PI(3,4,5)P3-Akt-NF-κB信号通路,进而影响转录因子KLF2表达密切相关。3.角膜组织中浸润的CD4+T淋巴细胞及其SHIP-1表达可能参与了HSK临床患者的疾病发展。