背景:手术切除是目前临床根治恶性实体肿瘤最为常用的方法之一,但手术切除肿瘤过程中通常会在一定程度上挤压瘤体或因结扎血管而增加瘤体局部血管内压力,这些因素都可促进或直接造成肿瘤细胞/肿瘤干细胞脱落进入血液、淋巴液和体腔,通过这些渠道形成转移灶,导致肿瘤转移、复发。手术前或手术过程中脱落进入血液循环中的游离肿瘤细胞是术后复发的重要高危因素。静脉全身化疗对于绝大多数恶性肿瘤患者手术后生存期的改善并不明显,特别是一些对于化疗药物不敏感的肿瘤细胞,术前或术中进入血液循环后,很难通过术后全身化疗的方法杀灭、清除,最终造成肿瘤远处转移、复发,导致手术治疗失败。即使是对于化疗敏感的肿瘤细胞,由于手术创伤的原因,患者通常无法承受术后立即全身化疗对身体带来的打击,需要恢复一定时间后方能接受化疗。而这段恢复期,足以使循环肿瘤细胞(circμlating tumor cells,CTCs)/循环肿瘤干细胞(circμlating tumor stem cells,CTSCs)通过血行途径发生远处转移。基于核黄素光化学技术(riboflavin photosensitized treatment,RPT)在血液制剂病毒、细菌、原虫灭活以及淋巴细胞灭活预防输血相关移植物抗宿主病(transfusion-related graft-versus-host disease,TA-GVHD)实践中的成功经验,我们提出在恶性肿瘤患者围术期利用RPT技术处理外周血液,以求灭活外周血液中CTCs/CTSCs,阻断恶性肿瘤血行转移途径的设想。我们选择HCT116结直肠癌细胞株作为研究对象,模拟患者外周血中的CTCs/CTSCs,通过体外细胞试验和动物试验探索RPT技术灭活CTCs/CTSCs的可行性、有效性以及安全性。第一部分:RPT灭活HCT116人结直肠癌细胞的效果评价目的:采用不同核黄素(riboflavin,RF)浓度、不同紫外线(μltraviolet,UV)照射剂量处理HCT116细胞和人淋巴细胞,同时评价RPT处理对HCT116肿瘤细胞、人淋巴细胞造成的损伤,遴选出能够使HCT116细胞失去增殖能力而又对淋巴细胞损伤最小的RF浓度和UV光照剂量范围。方法:将HCT116细胞置于培养皿中,根据不同的实验分组加入相应浓度的RF溶液,并进行相应剂量的UV照射处理。将RF浓度设计为1μmol/L、5μmol/L、15μmol/L;UV光照时间设计为5min和1Omin,共分为6个实验组,分别为A组:RF 浓度1μmol/L,光照 5min(1,5);B 组:RF 浓度 5μmol/L,光照 5min(5,5);C组:RF 浓度 15μmol/L,光照 5min(15,5);D 组:RF 浓度 1μmol/L,光照 1Omin(1,10);E 组:RF 浓度 5μmol/L,光照 lOmin(5,10);F 组 RF 浓度 15μmol/L,光照1Omin(15,10)。对照组为不添加RF、不进行UV光照处理的正常HCT116细胞。人淋巴细胞处理条件与HCT116细胞完全相同。评价不同处理条件下HCT116肿瘤细胞凋亡率和成瘤性,人淋巴细胞凋亡率及细胞因子分泌能力。结果:1.随着RF浓度及UV照射剂量增加,HCT116细胞和人淋巴细胞凋亡率都逐渐增加,但淋巴细胞对辐照剂量比较敏感,但对于RF浓度相对不敏感。从结果可以看出,RPT对肿瘤细胞的损伤明显大于对淋巴细胞的损伤,在保持淋巴细胞一定功能的情况下可以实现对肿瘤细胞的灭活;2.RPT处理后淋巴细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-17A和TFN-y浓度均随着RF浓度及UV辐照剂量增高而减低,都表现出对RF浓度和UV强度的剂量效应;3.经RPT处理后的HCT116细胞(实验1组、2组)在NOD/SCID小鼠体内未成瘤,但未经RPT处理HCT116细胞(阳性对照组)在NOD/SCID小鼠体内成瘤,说明RPT可以有效灭活HCT116细胞,使其失去增殖能力。结论:RPT处理对于HCT116细胞和淋巴细胞的损伤是有差异的,HCT116细胞更易于受到RPT损伤。因此,有可能在使淋巴细胞保持足够免疫功能的条件下使HCT116细胞失去增殖能力。第二部分:RPT灭活模拟外周血中CTCs(HCT116细胞)的效果评价目的:探索RPT灭活模拟外周血中HCT116肿瘤细胞,寻找一个可能存在的RPT技术条件,既能使HCT116肿瘤细胞失去增殖能力,又能使红细胞损伤、凝血功能、免疫功能控制在一个机体可以耐受的范围内,实现对外周血中CTCs的灭活,以期在恶性肿瘤患者围术期治疗中得到应用,提高恶性肿瘤根治率。方法:将健康供者全血(采集时间不超过2h)与HCT116肿瘤细胞以一定比例混合,使得HCT116细胞的终浓度为5×105/ml。加入终浓度为50μmol/L的RF,混匀后将混合全血转移至EVA透光储血袋中,并置于UVA(波长365nm)和UVB(波长310nm)交替光源中照射,照射环境温度控制在(6±2)℃。根据UV照射剂量不同分为实验1组(剂量7.2J/Cm2)和实验2组(剂量10.8J/cm2),同时以不加RF也不进行UV照射处理作为对照组;采用CD326免疫分选磁珠分选、富集混在全血中的HCT116肿瘤细胞,检测HCT116肿瘤细胞的凋亡率及成瘤性;使用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离RPT处理后全血中的淋巴细胞,评价其凋亡率及细胞因子分泌能力;采用TEG技术评价RPT处理后全血的凝血功能;检测RPT处理后全血中游离血红蛋白浓度,计算红细胞溶血率,评价红细胞损伤情况。结果:1、CD326免疫分选磁珠对全血中HCT116肿瘤细胞进行分选后的细胞纯度为(97.20±2.36)%,可有效完成模拟外周血中HCT116细胞的分选、富集,得到纯度较高可用于后续研究的HCT116细胞;2、对照组、实验1组和实验2组HCT116凋亡率分别为6.88%、37.99%和41.98%,实验1组和实验2组与对照相比,细胞凋亡比例明显增加,且随着照射剂量增加而增加;3、对照组6只NOD/SCID小鼠均长出肿瘤,平均体积为(0.996±0.42)cm3,实验1组6只NOD/SCID小鼠均长出肿瘤,平均体积为(0.234±0.19)cm3,实验2组6只NOD/SCID小鼠均未长出肿瘤。HE染色及免疫组化检测结果显示对照组及实验1组剥离出的肿瘤即为HCT116结肠癌组织,实验2组剥离的组织为正常结缔组织,并未发现HCT116细胞;4、对照组、实验1组和实验2组淋巴细胞存活率分别为(84.63±6.30)%、(81.66±6.73)%和(81.25±7.77)%,尽管淋巴细胞存活比例随着UV照射剂量增加而降低,但实验组与对照组之间没有统计学差异(实验1组vs.对照组,P=0.24,实验2组vs.对照组,P=0.22);5、经RPT处理后淋巴细胞分泌IL-10、INF-β、IFN-γ及IL-4的能力均有所减低,但与对照组相比没有显著的统计学差异(P>0.05);6、RPT处理外周血时会有一定热量产生,而热效应会导致外周血凝血功能受损,我们调整实验条件,将处理环境温度控制在(6±2)℃,凝血功能可控制在可接受范围内;7、对照组、实验1组和实验2组的红细胞溶血率分别为(0.02±0.02)%、(0.07±0.03)%和(0.10±0.04)%,RPT处理外周血会导致红细胞溶血率增加,但远低于全血及成分血保存期末溶血率的质量控制标准。结论:通过体外细胞实验、动物实验初步验证了一种可用于肿瘤患者灭活其CTCs的RPT(RF50μmol/L,UV剂量10.8J/cm2)技术的可行性,有望通过该技术使肿瘤患者外周血液中的CTCs失去增殖能力,最大限度的保持患者血液细胞、凝血及免疫功能。第三部分:RPT灭活模拟术中回收血液中HCT116的实验研究目的:评价RPT对术中回收血液中混杂的肿瘤细胞的灭活效果以及对红细胞造成的叠加损伤,探寻建立一种可用于恶性实体肿瘤患者术中血液回收的新技术。方法:将健康供者全血与HCT116细胞以一定比例混合,使得HCT116细胞的终浓度为5×105/ml,加入终浓度为50μmol/L的RF,混匀后将混合血液转移至EVA透光储血袋中,并置于UVA(365nm)和UVB(310nm)交替光源中照射,环境温度控制在(6±2)℃,根据照射剂量不同分为实验1组(剂量18J/cm2)、实验2组(剂量23.4J/cm2)和实验3组(28.8J/cm2),同时以不加RF也不进行光照处理作为对照组。使用Cell Saver Elite机器及配套耗材模拟术中血液回收程序对RPT全血进行处理,评价不同RPT条件的肿瘤灭活效果及红细胞损伤程度。结果:1、对照组、实验1组、实验2组和实验3组的HCT116凋亡率分别为(7.52±0.69)%、(52.94±1.12)%、(61.46±2.79)%、(66.14±4.57)%,实验 1 组vs.对照组P=2.2E-12,实验2组vs.对照组P=2.8E-10,实验3组vs.对照组P=6.2E-09;2、对照组6只小鼠均长出肿瘤,肿瘤体积为(0.608±0.380)cm3,实验1组、实验2组和实验3组共18只小鼠均未长肿瘤;3、对照组、实验1组、实验2组、实验3组红细胞上清液中游离血红蛋白含量分别为(0.14±0.09)g/L、(0.32±0.09)g/L、(0.36±0.08)g/L和(0.41±0.07)g/L,实验1组vs.对照组 P=0.00081,实验2组vs.对照组P=0.00007,实验3组vs对照组P=0.000002:4、对照组、实验1组、实验2组、实验3组红细胞溶血率分别为(0.07±0.04)%、(0.15±0.04)%、(0.17±0.04)%和(0.20±0.03)%,实验 1 组vs.对照组P=0.00081,实验2组vs.对照组P=0.00007,实验3组vs.对照组P=0.000002;5、各组回收红细胞上清液Ca、Cl、CO2及Na浓度无明显差异(P>0.05);与对照组相比,实验2组、实验3组K离子浓度明显升高(P<0.05)。LDH浓度随UV照射剂量增加而增加,但与对照组相比,无统计学差异(P>0.05);6、对照组、实验1组、实验2组和实验3组红细胞内ATP含量分别为(2.78±1.99)μmol/gHb、(2.64±1.40)μmol/gHb、(2.89±2.11)μmol/gHb和(3.54±1.95)μmol/gHb。实验1组vs.对照组,P=0.87:实验2组vs.对照组,P=0.91:实验3组vs对照组,P=0.43。结论:采用终浓度50μmol/L的RF、18J/cm2UV照射剂量能够有效灭活术中回收血液中的HCT116肿瘤细胞,使其失去增殖能力。同时,这种条件的RPT处理对于红细胞结构和功能损害是有限的。RPT处理有望使恶性实体肿瘤患者IBS成为常规。