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背景自噬是程序性细胞存活的一种形式,作为一种溶酶体的降解途径,细胞自噬主要降解损伤的细胞器和一些长寿蛋白,对于细胞的稳态起着非常重要的作用。HMGB1是一个经典的损伤相关模式分子,可以调节细胞的发育、分化、炎症和代谢等过程。我们实验室之前的研究表明,胞外的HMGB1可以促进HTLV-1感染的T细胞自噬。HTLV-1病毒编码的肿瘤蛋白Tax控制着多种重要的细胞信号途径,对细胞自噬也有一定的调节作用。但是,在胞外HMGB1介导的细胞自噬中,Tax蛋白的作用还不清楚。目的研究Tax蛋白对细胞自噬的调节作用,研究Tax蛋白在胞外HMGB1介导自噬中的作用;探讨Tax蛋白在胞外HMGB1介导自噬中作用的可能机制。方法1.细胞培养:Hela细胞在37℃、含有5%CO2和一定湿度的细胞培养箱中培养,所用培养基为含10%胎牛血清、2mML--谷氨酰胺、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素的RPMI 1640或DMEM培养基。每天观察细胞状态和密度,平均每2天更换新鲜培养基1次,3天传代1次。2.质粒的提取:LC3B-EGFP-mCherry荧光质粒菌液,pCMV-Neo、pCMV-Tax、pCMV-Tax-m47、pCMV-Tax-m22质粒菌液,涂板、挑单克隆、摇菌和保存菌种后,按天根无内毒素大提质粒试剂盒上的说明提取相关质粒,验证所提质粒的浓度和纯度。3.细胞转染:用lip 2000将LC3B-EGFP-mCherry、pCMV-Neo、pCMV-Tax、pCMV-Tax-m47和pCMV-Tax-m22质粒转染入Hela细胞,转染完成后6h更换预热的、含血清但不含双抗的完全培养基,48h后收集蛋白用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、p62等的表达水平或用共聚焦显微镜观察自噬体形成的多少。4.药物处理:细胞转染后,使用终浓度为1μg/mL的重组人HMGB1(rhHMGB1)处理Hela细胞,用Western blot和共聚焦显微镜观察相关指标的变化情况。5.指标检测:分别提取rhHMGB1处理组和对照组的Hela细胞中的蛋白,用Western blot方法分析LC3、P62等蛋白的变化情况;转染入质粒并用rhHMGB1处理后,用共聚焦显微镜观察各组自噬体形成的多少。6.统计学分析:用SPSS19.0软件对数据进行处理,结果用均数±标准差(?x±s)的形式表示,t检验用于两组均数的比较,p<0.05表示差异有统计学意义。结果1.双荧光素酶报告基因检测结果显示真核表达质粒pCMV-Tax和pCMV-Tax-m47表达产物的NF-?B活性明显高于pCMV-Neo和pCMV-Tax-m22表达产物的NF-?B活性。2.Western blot结果显示,将Hela细胞中转入pCMV-Tax或pCMV-Tax-m47质粒后,与对照组相比,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显升高。而转入pCMV-Tax-m22质粒后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值没有明显变化。3.Western blot结果显示,当质粒pCMV-Tax或pCMV-Tax-m47转染入Hela细胞并用rhHMGB1处理后,相较于单用rhHMGB1处理,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值变化更明显。4.共聚焦结果显示:Hela细胞用rhHMGB1处理或转染入pCMV-Tax和pCMV-Tax-m47质粒后,自噬体明显增多且部分聚集成团块状。两因素共同存在时,自噬体的形成更多。5.共聚焦结果显示:将真核表达质粒pCMV-Tax和LC3B-EGFP-mCherry共同转染入Hela细胞再用rhHMGB1处理后,相对于pCMV-Neo对照组,实验组仅可以看到黄色自噬体,对照组可以看到黄色自噬体和红色自噬体。结论HTLV-1病毒蛋白Tax的表达可以促进胞外HMGB1对自噬的调节作用,这种作用可能是通过NF-?B信号通路来实现的。