L-苹果酸是一种重要的天然有机酸,TCA循环中关键的一环,广泛应用于食品、医药及化工等众多领域,市场前景巨大。微生物发酵法生产L-苹果酸具有许多优点和良好的应用前景,成为近年来的研究热点。但使用野生型菌株发酵生产L-苹果酸,往往会产生大量副产物,而通过基因工程手段构建的L-苹果酸工程菌株可消除副产物的影响,引导碳代谢更多地流向目标产物。谷氨酸棒状杆菌因其遗传背景清楚,操作简单,因而通过基因操作技术定向改造谷氨酸棒杆菌进行L-苹果酸发酵,理论上有可行性。首先,本文建立了简易粗略的产物检测方法以及直观精确的液相色谱检测方法。液相检测色谱条件为:紫外检测器,色谱柱为BDS HYPERSIL C₁₈柱,4.6×200 mm,流动相:乙腈和20 mmol/L KH₂PO₄（pH 2.8）混合液（v:v=1:99）,流速0.5 mL/min。检测波长210 nm,柱温29℃,进样量20μL。该方法快速、准确、重现性好。以C.glutamicum ATCC13032为出发菌株,通过已知的代谢流分析,设计了基因敲除和sacB基因反向筛选策略,通过逐个基因敲除操作与分子验证相结合,获得了共敲除pqo、pdh、lldh、malE、mqo五个基因的工程菌株,命名为M5（C.glutamicum ATCC13032 M5）,在分子验证的基础上,高效液相色谱检测到发酵液中L-苹果酸的胞外积累,证明了理性设计策略工程菌株M5的合理性。其次,本文着重研究了碳源、氮源、乙酸盐、碳酸氢钠等诸多因素,对于谷氨酸棒杆菌工程菌株M5发酵产生L-苹果酸产量的影响。最终确立了优化培养基配方（g/L）:葡萄糖50、乙酸钠5、KH₂PO₄ 1.5、MgSO₄·7H₂O 0.5、（NH₄）₂SO₄ 5、CaCl₂ 0.2,NaHCO₃调节pH 7.0;添加维生素:B₂、B₅、B₆、B₁₂、NA、Fa、Biotin;经过摇瓶发酵72 h,得到L-苹果酸产量23.5 g/L,糖酸转化率66.4%。对工程菌株M5发酵工艺进行优化,确定发酵最佳工艺条件:接种量2.5%,培养温度30℃,初始pH 7.0,好氧发酵36 h,转换成限氧发酵,pH稳定在7.5,发酵72 h。2 L罐菌种发酵终了时,505 mL发酵液中测的L-苹果酸16.21 g,质量收率为69.8%,摩尔转化率为94.5%。2 L罐连续多批次发酵实验,L-苹果酸的平均终浓度为32.16 g/L,平均转化率为69.38%。最后,初步对发酵液中L-苹果酸的结晶工艺进行了探索,结晶的最佳工艺为:活性炭用量4%,脱色2 h,减压过滤,70℃浓缩,浓缩至原体积的1/2,梯度降温结晶,可以获得相对高纯度和高收率的L-苹果酸,L-苹果酸结晶纯度可达83%以上,总收率可达76.7%。