茅苍术(Atractyodes lancea)为菊科苍术属多年生宿根草本植物,其干燥根茎为著名药材苍术,具有燥湿、健脾、祛风、散寒、明目等功效,主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿、消化不良等症。产于江苏省茅山地区的茅苍术品质最佳,为道地苍术药材。茅苍术药用活性成分为挥发油,主要包括以β-石竹烯、姜烯、β-倍半水芹烯、氧化石竹烯、茅术醇、β-桉油醇、苍术酮为主的倍半萜类物质和以苍术素为主的聚乙炔类物质。近年来,由于过度采挖、生境破坏,加上茅苍术结实率低、根茎生长缓慢,野生茅苍术资源已趋枯竭,但市场对道地苍术药材的需求日益增加,供需缺口逐年加大。虽然药材的人工栽培在一定程度上能缓解野生资源的需求压力,但茅苍术人工栽培存在易发生病害、连作障碍等问题。此外,栽培茅苍术中活性成分的含量和多样性均低于道地药材。药材活性成分的改变将导致现有多种中药配方疗效降低,极大地影响我国传统中药产业,是我国药材种植遇到的主要问题。本课题组前期研究证明,茅苍术中存在丰富的内生真菌资源,多株内生真菌能促进茅苍术挥发油积累、提升其品质。然而,现有内生真菌对茅苍术挥发油积累的促进效果尚不能满足药材栽培的需求。由于挥发油强烈的抑制细菌能力,那么茅苍术中是否存在内生细菌,内生细菌对茅苍术的生长和挥发油积累存在何种作用是值得探讨的问题,有望发现更多能提高茅苍术药材品质的共生微生物资源。本论文通过分离和筛选,得到一株更加高效促进茅苍术挥发油积累的内生细菌ALEB7B,鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),内生细菌ALEB7B能促进茅苍术组培苗中挥发油含量增加78%。因此,茅苍术和荧光假单胞菌ALEB7B互作是一个很好的模型,从多角度阐述内生细菌提高药用植物生态适应性和次级代谢物积累的作用机制。首先,我们分离了生长在江苏省茅山地区的道地茅苍术中的内生细菌,使用核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)和BOX-PCR对内生细菌多样性进行分析。分离到的45株内生细菌经ARDRA分析后,归入14个聚类簇,簇内菌株的BOX-PCR指纹图谱相似度较低,显示出茅苍术内生细菌丰富的多样性。各聚类簇代表菌株的16SrRNA序列分析表明,分离得到的内生细菌属于泛菌属(Pantoea)、微杆菌属(Microbacterium)、短杆菌属(Curtobacterium)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus),其中假单胞菌属为优势内生细菌。通过特定培养基的筛选,10株内生细菌能在Burk’s无氮培养基上生长,具有固氮潜力;19株和15株内生细菌分别能在NBRIP和蒙金娜有机磷培养基上生长,具有溶解无机磷和有机磷能力;24株内生细菌能在硅酸盐培养基上生长,具有解钾能力;43株内生细菌能利用L-色氨酸为底物合成吲哚乙酸(IAA)。该部分研究首次揭示了江苏省道地药材茅苍术中丰富的内生细菌资源及其植物促生潜力。其次,我们在分离得到的内生细菌中筛选到一株能高效促进茅苍术挥发油积累的内生细菌ALEB7B。根据16SrRNA、rpoD、gyrB基因序列的比对结果,内生细菌ALEB7B鉴定为荧光假单胞菌。由于荧光假单胞菌ALEB7B能够分泌IAA,且接种ALEB7B后,茅苍术内源IAA含量升高,表明荧光假单胞菌ALEB7B合成的IAA可能参与促进茅苍术挥发油积累。进一步验证外源IAA对茅苍术挥发油积累的影响,随IAA浓度增加,茅苍术组培苗生根数增加。当浓度为0.5 mg L-1时,IAA显著促进茅苍术中挥发油的积累,表明荧光假单胞菌ALEB7B可能通过促进植物根系发育,增加养分吸收,为次级代谢物合成提供了物质和能量基础。此外,植物IAA流入载体AUX1/LAX特异性抑制剂1-萘氧乙酸逆转了荧光假单胞菌ALEB7B诱导的茅苍术组培苗内源IAA和挥发油含量的增加,表明细菌分泌的IAA通过植物细胞膜上的载体流入植物细胞,干扰植物生长素信号,诱导相关基因表达,促进植物次级代谢。第三,我们研究了荧光假单胞菌ALEB7B对茅苍术生态适应性的影响。荧光假单胞菌ALEB7B能抑制茅苍术白绢病病原真菌罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SY4的生长,并显著降低白绢病的发病率。扫描电子显微镜观察证明荧光假单胞菌ALEB7B能稳定定殖于茅苍术中。值得注意地,该章研究首次报道荧光假单胞菌ALEB7B生长于Luria-Bertani培养基上时,能释放大量抑制罗耳阿太菌生长的挥发性物质,其中二甲基二硫醚起主要抑菌作用。内生细菌发酵液也具有抑制病原真菌的能力,其中2-哌啶酮起主要作用。荧光假单胞菌ALEB7B的其他拮抗策略还包括产生抗生素,分泌细胞壁水解酶,分泌铁载体等。该章研究为茅苍术人工栽培中的病害防治,提供了一株具有实际应用价值和生态友好型的拮抗菌株。由于荧光假单胞菌ALEB7B能释放大量具病原真菌拮抗能力的挥发性物质,我们推测ALEB7B释放的挥发性物质对茅苍术的生长和挥发油积累也存在影响。该章研究发现荧光假单胞菌ALEB7B生长于Murashige-Skoog(MS)培养基上时,能释放多种含氮挥发性物质,证明甲酰胺和N,N-二甲基甲酰胺能显著促进茅苍术生物量积累。然而,在茅苍术-荧光假单胞菌ALEB7B共生体中未检测到ALEB7B释放的含氮挥发性物质,推测含氮挥发物可能被茅苍术消耗而未被检测到。此外,荧光假单胞菌ALEB7B主要挥发物苯甲醛通过诱导植物抗性反应,增加茅苍术挥发油积累。在茅苍术-荧光假单胞菌ALEB7B共生体中检测到苯甲醛的释放,能够影响周围未感染植株,扩展了内生细菌的生态功能。该章研究首次证明内生细菌对宿主植物的影响不局限于已知的物理接触,加深了现有对植物和内生细菌互作的认识。前期研究证明,荧光假单胞菌ALEB7B能产生多样的代谢物,其都具有成为诱导子的潜力。此外,荧光假单胞菌为革兰氏阴性细菌,具有合成和分泌蛋白诱导子的能力。本章研究证明荧光假单胞菌ALEB7B分泌的蛋白和多糖诱导子能显著增加茅苍术HMGR基因的表达,促进茅苍术倍半萜合成。进一步研究表明,诱导子处理诱导茅苍术中活性氧(ROS)的迸发,我们推测荧光假单胞菌ALEB7B及其分泌的诱导子诱导植物体内迸发的ROS引起了倍半萜氧化。由于不能增加倍半萜合成前体的来源,诱导子仅诱导不同倍半萜之间的转化。而ALEB7B接种增加茅苍术中倍半萜合成前体的积累,包括乙酰辅酶A、丙酮酸等,因此,ALEB7B接种同时促进不含氧和含氧倍半萜的积累。此外,荧光假单胞菌ALEB7B分泌的蛋白和多糖诱导子对不同含氧倍半萜积累的促进存在差异,暗示不同诱导子促进茅苍术挥发油积累过程中激活的信号途径存在差异。进一步鉴定ALEB7B胞外多糖的组分,证明胞外多糖是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖。经过分离、纯化,得到一个荧光假单胞菌ALEB7B胞外蛋白,经鉴定为溶质结合蛋白,能够显著促进茅苍术中氧化石竹烯、茅术醇、β-桉油醇、苍术酮的积累。该章研究证明不同诱导子诱导不同倍半萜组分的合成,荧光假单胞菌ALEB7B对茅苍术倍半萜积累的高效促进是多种诱导子的协同作用。围绕上部分研究提出的荧光假单胞菌ALEB7B及其诱导子诱导茅苍术中ROS迸发,氧化倍半萜,增加含氧倍半萜积累的假设开展研究。荧光假单胞菌ALEB7B定殖茅苍术后,诱导的ROS迸发与含氧倍半萜积累显示出同步变化趋势。外源过氧化氢(H2O2)和单线态氧在诱导茅苍术内源ROS迸发的同时促进含氧倍半萜的积累。相反,活性氧清除剂抗坏血酸预处理显著抑制了 ALEB7B诱导茅苍术ROS的迸发及含氧倍半萜的积累。体外氧化实验证明茅术醇、氧化石竹烯、环氧葎草烯Ⅱ、匙叶桉叶油醇等多种含氧倍半萜能够由H2O2或单线态氧直接氧化得到。因此,该部分研究证明内生细菌定殖诱导宿主植物迸发的ROS能够直接氧化倍半萜,增加茅苍术中含氧倍半萜的含量和多样性。该章研究不仅为阐明多种药用植物中含氧萜类合成及多样性形成的机制提供了新思路,而且对进一步认识植物和内生细菌互作的机制具有重要意义。最后,内生细菌侵染诱导植物迸发的ROS不仅能直接氧化倍半萜,而且能作为信号分子,激活下游激素信号转导,促进茅苍术中倍半萜的合成。该章研究证明荧光假单胞菌ALEB7B定殖后,首先激活茅苍术中的H2O2信号,H2O2分别激活下游的赤霉素(GA)和乙烯(ET)信号,而ET进一步激活下游的脱落酸(ABA)信号,GA和ABA直接增加编码倍半萜合成关键酶的HMGR和DXR基因的表达,并提高相应酶的活性,促进茅苍术中倍半萜的合成。荧光假单胞菌ALEB7B促进茅苍术挥发油合成过程中特定的ROS和激素信号级联能够解释其更高效地促进茅苍术挥发油积累的原因。荧光假单胞菌ALEB7B高效促进茅苍术挥发油合成机制的阐明不仅为多种药用植物中萜类活性成分的诱导合成提供了理论基础,而且进一步揭示了不同内生菌与宿主植物互作的复杂性。总之,本论文以活性物质丰富且明确的道地药材茅苍术和对挥发油积累促进效果显著的内生细菌荧光假单胞菌ALEB7B的互作为模型,从多角度阐述内生细菌促进药用植物生态适应性和药用活性成分积累的机制,为将内生菌应用于药材生产实践提供理论基础,也将为高品质药材的人工栽培提供技术支持。