在高麦芽糖浆的工业生产过程中,真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的终产物中麦芽糖浓度的高低是评价其应用性能的一个重要特征指标。目前,真菌α-淀粉酶高麦芽糖生成能力的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性质研究阶段,而有关真菌α-淀粉酶结构与其高麦芽糖生成能力之间关系的研究则未见报道,即没有结合酶蛋白质结构分析从根本的分子水平上加以研究,使得真菌α-淀粉酶的高麦芽糖生成能力及其作用机制一直没有得到合理的阐释。因而,本文在研究中利用计算机辅助模拟分析技术对米根霉αα-淀粉酶与麦芽三糖进行分子对接并选择可能与该酶的高麦芽糖生成能力相关的氨基酸残基进行突变及构建突变体,分析对比原酶与突变体之间的酶学性质差异,从而确定影响高麦芽糖生成的关键氨基酸。主要研究内容包括:(1)利用计算机技术对蛋白质的结构进行模拟和分析,寻找米根霉α-淀粉酶与麦芽三糖对接后相互作用氨基酸,并模拟突变后的突变体与麦芽三糖对接模拟图,通过与原酶的对接模拟图进行对比、分析,探究突变体与原酶在对接模拟时模拟图上显示的结构的差异,为下一步实验提供理论基础及突变位点选择。(2)通过重叠PCR完成定点突变,构建突变体,并对突变体进行筛选,进一步对突变体进行上罐发酵,在得到发酵酶液后,对酶学性质进行分析。通过分析酶学性质发现,原酶ROAmy的最适温度50℃、最适pH为5.5,而突变体YHR(Y80、H286、R333全部突变为Leu)的最适温度提高到60℃,最适pH不变,同样为5.5。突变体H286L的最适作用pH为5.0,比原酶减低了0.5,最适温度提高到55℃,比原酶提高了 5℃,而Y80L、R333L与原酶相比,并没有显著变化。(3)相比于原酶ROAmy,突变体YHR在以淀粉为底物水解8h后,生成的麦芽糖提高了 11.67%,在以麦芽三糖为底物水解8 h后,消耗麦芽三糖生生成麦芽糖时提高了 18.87%,分析Y80L、H286L、R333L以麦芽三糖及淀粉为底物的终产物,发现突变体H286L在以淀粉为底物时生成麦芽糖提高了10.32%,在以麦芽三糖为底物时生成麦芽糖提高了 16.87%。这些实验,确定了H286的突变(L)对底物转化能力具有提升作用。进一步对H286进行饱和突变,分析突变体在以麦芽三糖及淀粉时的终产物,可以发现突变体H286M也有一定的正向突变作用。(4)通过分析ROAmy与麦芽三糖的对接结果,发现配体麦芽三糖对接周围有四个较为特殊的组氨酸氨基酸,以这四个氨基酸为突变点,构建了4个突变体,分析对接结果及水解麦芽三糖及淀粉终产物可以发现,除H286外,其他三个组氨酸位点生成的终产物中麦芽糖与原酶相比差异较小,因而这三个组氨酸位点可能并不是产麦芽糖关键氨基酸。(5)通过对部分保守区域氨基酸进行突变,获得10个突变体,分析这些突变体在水解淀粉及麦芽三糖上与原酶的终产物并与原酶进行对比,从对比结果可以发现,这10个突变体中仅有D284L及N285L在以淀粉为底物生成麦芽糖时提高了 12.56%、10.84%,在以麦芽三糖为底物生成麦芽糖时提高了 8.38%、7.45%。另外8个突变体在以淀粉及麦芽三糖为底物时,生成的终产物中麦芽糖含量变化不明显。