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目的:原发性肝癌(Primary carcinoma of the liver)简称肝癌,是全球十大肿瘤之一,每年有近60万人因此死亡。我国是肝癌的高发区,且其发病率有不断攀升的趋势。原发性肝癌起病隐匿,确诊时病情大多已经处于晚期,已失去手术根治的最佳时间,且该病手术后的复发率高,放疗、化疗、靶向治疗等其他非手术治疗手段虽可在一定程度上控制肝癌的发展,但同时这类治疗对患者的身与心造成的继发性伤害也较大。因此,探寻安全有效的抗肝癌药物具有重大的现实意义。姜黄、黄芪及绞股蓝是临床上常用的传统中药材,研究表明其均具有抗肿瘤作用,但是姜黄、黄芪及绞股蓝各自提取物的抗肿瘤细胞增殖作用均具有其局限性,因此,本课题遵循中医药配伍取效的特点,将姜黄、黄芪、绞股蓝等六味中药按不同比例组成配方,以期各药物相互作用,达到协同增效的效果,分别用95%、75%乙醇进行成分提取,并进行肝癌细胞增殖抑制、胞内分布、细胞凋亡的观察研究。方法:1.设立多个以姜黄为主要成分的配方,分别用95%、75%乙醇提取其中有效成分。2.以人肝癌SMMC-7721、SK-HEP-1和HepG2细胞及正常肝细胞L02为研究对象,用MTT法、细胞形态学观察法,观察95%乙醇提取物分别对3株人肝癌细胞作用48 h、72 h和96 h的增殖抑制情况及对正常肝细胞L02的毒性。观察75%乙醇提取物对肝癌细胞增殖抑制情况方法同上。比较两种不同浓度乙醇提取物的作用强弱,并筛选出对药物作用最敏感的细胞株和增殖抑制效果最好的提取物。3.用激光共聚焦扫描显微镜观测药物R1、R7在3株肝癌细胞内分布状态。4.应用流式细胞术分析药物R1、R7作用肝癌SMMC-7721细胞的凋亡作用。结果:1.成功分别用95%、75%乙醇制备出以姜黄为配方的提取物。2.MTT实验显示:95%乙醇提取的药物R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7对三株肝癌细胞的生长抑制作用具有一定的浓度、时间依赖性,药物R3、R4、R5对3株肝癌细胞增殖的抑制作用均明显低于其他四药,作用72 h后,药物R3对SMMC-7721、SK-HEP-1、HepG2细胞的IC50分别为203μg/ml、211μg/ml、220μg/ml,R4、R5的IC50均未测出;药物R1、R2、R6、R7作用三株肝癌细胞48 h后,抑制作用大小均为R1>R7>R6>R2,作用72 h及96 h后,对SMMC-7721细胞和HepG2细胞增殖的抑制作用大小均为:R1>R7>R6>R2,对SK-HEP-1细胞增殖的抑制作用大小均为:R1>R6>R7>R2,其中药物R6、R7对SK-HEP-1细胞增殖的抑制作用接近。75%乙醇提取的药物R1’、R2’、R6’、R7’对三种肝癌细胞在48 h、72 h、96 h均仅药物R1’测出IC50,且以SMMC-7721细胞对药物作用最敏感,R2’、R6’、R7’的IC50均未测出。两种不同容积乙醇提取的药物相比较,95%乙醇提取物的抗肝癌细胞增殖作用明显优于75%乙醇提取物,作用72 h及96 h,药物R1’对SMMC-7721细胞的IC50较R1对该细胞的IC50上升均大于1倍。以姜黄的配方提取物R1、R7具有良好的肿瘤细胞增殖抑制活性。肝癌SMMC-7721细胞对药物作用最敏感。药物R1、R2、R6、R7对L02正常肝细胞的毒性均较低。3.SMMC7721、SK-HEP-1、HepG2细胞给药组的细胞核不仅被PI染料染成蓝色,同时出现了药物的绿色荧光,而未给药的空白组只有PI染色的蓝色荧光,由此可见,药物R1、R7主要进入到癌细胞的细胞核内发挥抗癌作用。4.以不同浓度(20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml)的药物R1和R7作用SMMC-7721细胞48 h,凋亡率分别为19.89%、12.76%、8.86%和15.78%、11.80%、8.73%。说明药物R1和R7均能促进SMMC-7721细胞凋亡,且凋亡作用具有浓度依赖性,浓度越高,凋亡作用越强。结论:1.以姜黄为配方的提取物R1、R7具有良好的肝癌细胞增殖抑制活性,且对肝正常细胞L02毒性小;SMMC-7721细胞对药物作用最敏感。2.95%乙醇提取物的抗肝癌细胞增殖作用优于75%乙醇提药物。3.药物R1、R7主要进入到癌细胞的细胞核内发挥抗癌作用。4.药物R1、R7均能通过促凋亡机制发挥肝癌细胞增殖抑制作用。