论文部分内容阅读
目的本实验采用脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),建立RAW264.7炎症模型,通过该模型指导白及活性组分分离纯化,从分子水平研究白及活性单体成分对LPS刺激RAW264.7炎症模型的抑制作用,并探讨其作用机制。方法体外培养RAW264.7细胞,通过LPS刺激RAW264.7细胞建立巨噬细胞炎症模型,采用RT-PCR方法确定LPS诱导RAW264.7细胞IL-1β mRNA表达升高的最适浓度和最适作用时间。运用醇提-聚酰胺色谱分离制备白及醇提物,用巨噬细胞炎症模型评价药物效应,指导白及活性组分分离纯化,并对单体成分进行结构鉴定。采用MTS法检测细胞存活率,确定白及单体对LPS刺激RAW264.7细胞最适作用浓度。光学显微镜下观察各实验组RAW264.7形态学变化,流式细胞术检测RAW264.7细胞胞外IL-6、TNF-α和MCP-1 的细胞因子含量;RT-PCR检测IL-1β、IL-6、iNOS、COX2、TNF-α、TGF-β的mRNA表达情况;Western Blot检测白及单体对LPS刺激RAW264.7细胞MAPK通路、NF-κB通路、COX2、iNOS、p-IRF3/IRF3的蛋白表达情况。结果1.通过RT-PCR法检测LPS对RAW264.7细胞IL-1β的mRNA相对表达量的影响,IL-1β mRNA相对表达量随着LPS浓度和作用时间增加而升高,且呈剂量依赖性,其中200 ng/mL LPS刺激6 h,即可使IL-1β的mRNA相对表达量提高将近1000倍。2.白及提取物经聚酰胺柱色谱分离所得五个粗分组分经HPLC表征,发现各粗分样品间交叉峰较少,分离效果较好。通过RAW264.7细胞炎症模型,结合RT-PCR分析表明,除80%乙醇洗脱粗分组分(E80)外,其余各粗分组分均可剂量依赖性降低RAW264.7细胞IL-1βmRNA相对表达量,与模型组比较有极显著性差异(P<0.01),其中40%乙醇洗脱组分(E40)抑制效果最为显著。3.白及40%乙醇洗脱粗分活性组分(E40)再经硅胶柱细分为E40-(1-6)六个亚组分,并进一步采用RAW264.7细胞炎症模型和RT-PCR分析IL-Iβ mRNA表达的抑制活性。结果表明,不同浓度各亚组分联合LPS作用于RAW264.7细胞6h后,其IL-1βmRNA相对表达量随剂量增加而降低;与模型组相比,除E40-6外,其余各亚组分均有极显著性差异P<0.01,其中尤以E40-3、E40-4抑制作用最明显。4.采用半制备液相色谱法对白及E40-3和E40-4两个活性亚组份进行分离、纯化,核磁共振波谱鉴定RT16.6为贝母兰宁(2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲),RT21.0为 batatasin Ⅲ(3’,3"-二羟基-5’-甲氧基联苄)。5.MTS检测不同浓度白及单体及联合LPS对RAW264.7细胞存活率的影响,未加LPS时,与正常对照组相比,单体组分RT16.6和RT21.0在低剂量时均有一定促进增殖作用,但浓度高于15 μg/mL时,对细胞有一定毒性。不同浓度单体成分联合LPS作用于RAW264.7 24 h后,与正常对照组相比,RT16.6在20 μg/mL、RT21.0在25μg/mL时,对细胞有一定毒性。6.光学显微镜下观察不同浓度白及单体作用于RAW264.7对其细胞形态学的影响,加入不同浓度白及单体后,与正常细胞相比,白及单体RT16.6在1-5μg/mL、RT21.0在2.5-10 μg/mL剂量范围内细胞数目略有增加,形态没有明显变化。7.采用流式细胞术检测不同浓度白及单体成分对LPS刺激RAW264.7细胞相关炎症因子表达影响,结果表明,模型组LPS刺激后可显著增加RAW264.7细胞培养上清中MCP-1、TNF-a、IL-6的含量,与正常组比较具有显著性差异(P<0.01)。与模型组相比,白及单体化合物RT16.6可剂量依赖性降低RAW264.7细胞外上清MCP-1和IL-6的含量,具有显著性差异(P<0.01);低剂量亦可降低TNF-a分泌量,但高剂量反而促进TNF-a分泌。白及单体RT21.0也可剂量依赖性降低MCP-1、TNF-a、IL-6的分泌,具有显著性差异(P<0.01)。8.荧光定量PCR检测不同浓度白及单体对LPS刺激RAW264.7细胞炎症相关基因mRNA表达的影响,与空白对照组相比,模型组加LPS后可增加IL-1β、IL-6、iNOS、COX2、TNF-α mRNA相对表达量,具有显著性差异(P<0.01),也增加TGF-βmRNA相对表达量,具有显著性差异(P<0.05)。白及单体RT16.6可减少各炎症基因的mRNA相对表达量,具有剂量依赖性。但在低剂量1 μg/mL时,COX2、TNF-α、TGF-β mRNA相对表达量比LPS组高,这可能与低剂量促进细胞增殖有关。白及单体RT21.0也可减少各炎症基因的mRNA相对表达量,除了 TNF-α外,均具有剂量依赖性,与模型组比较具有显著性差异(P<0.01)。9.Western Blot检测白及单体对LPS刺激RAW264.7细胞MAPK通路、NF-κB通路、COX2、iNOS、p-IRF3/IRF3的蛋白表达影响。结果表明,与正常对照组相比,模型组 IKK、IKBα、NF-KB、ERK1/2、JNK、P38、IRF3 磷酸化水平均明显升高(P<0.01),COX2、iNOS蛋白水平均明显升高(P<0.01);而与模型组相比,白及单体RT16.6和RT21.0均能够显著减少IKK、IKBα、NF-κB、JNK、IRF3磷酸化水平(P<0.01);在一定程度上也可剂量依赖性地抑制iNOS、COX2蛋白表达(P<0.01)。此外,白及单体RT16.6显著增加ERK、P38磷酸化(P<0.01);白及单体RT21.0能够显著减少P38磷酸化(P<0.01),增加ERK磷酸化;结论1.LPS浓度200 ng/mL刺激6 h即可显著增加RAW264.7细胞相关炎症基因表达水平,可用于相关药物抗炎活性筛选及相关分子机理研究。2.用上述条件建立的RAW264.7巨噬细胞炎症模型评价药物抗炎效应,结合柱色谱技术方法,指导白及活性组分分离纯化,获得两个单体成分,经核磁共振波谱鉴定RT16.6为贝母兰宁(2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲),RT21.0为batatasin Ⅲ(3’,3"-二羟基-5’-甲氧基联苄)。3.白及药效单体成分治疗肺纤维化疾病的可能分子机制为通过作用于NF-κB、p-IRF3/IRF3、MAPK、iNOS 和 COX2 等多个信号通路及靶点,降低 IL-1β、IL-6、iNOS、COX2、TNF-α和TGF-β等炎症基因表达和抑制MCP-1、TNF-α、IL-6等炎症因子分泌而实现。