目的:邻苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)是一种新兴的内分泌干扰化合物,并作为增塑剂广泛存在于日常生活用品中,比如个人护理用品、食品包装材料、医疗器械、儿童玩具以及建筑装饰材料等。邻苯二甲酸-单-乙基己酯(Mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)作为DEHP在生物体代谢过程中主要的活性产物,对人体细胞具有损伤作用。有研究证明DEHP会使胰岛β细胞受损,进而使自噬依赖性细胞凋亡并诱发胰岛素抵抗(IR),最终导致2型糖尿病。但目前MEHP对胰岛β细胞的损伤机理尚未完全研究清楚。吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine,PQQ)具有防止氧化应激,降低自由基水平和脂质过氧化(LPO)等作用,但其能否抑制MEHP诱导胰岛β细胞凋亡尚未证实。因此,本研究以大鼠胰岛β(INS-1)细胞为实验对象,旨在证明MEHP是否会对INS-1细胞造成自噬依赖性的细胞凋亡以及探究PQQ在这一过程中如何起保护作用。方法:不同浓度(0、6.25、12.5、25μM)的MEHP和5 m M PQQ+25μM MEHP处理INS-1细胞后,用western blot(蛋白质免疫印迹)法检测细胞LC3、p62、组织蛋白酶D、细胞色素c、caspase 9,3等相关蛋白表达的变化;用DCFH-DA荧光探针检测INS-1细胞内ROS含量的变化;用检测试剂盒测定INS-1细胞内GSH、MDA水平和SOD活性,以反映氧化应激程度的变化;用Olympus BX-63荧光显微镜观察INS-1细胞,在分别进行AO染色、JC-1染色与TUNEL染色标记后溶酶体膜稳定性与线粒体跨膜电位的变化,以及细胞是否凋亡;10 m M NAC预处理1h后,检测在MEHP处理的细胞中ROS生成量、自噬、溶酶体膜通透性增加(Lysosomal membrane permeabilization,LMP)、线粒体外膜通透性增加(Mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP)对INS-1细胞凋亡的作用关系;1 m M 3MA预处理2h后,检测在MEHP处理的细胞中自噬、LMP、MOMP和凋亡间的关系;100μM pepstatin A预处理4 h后,检测组织蛋白酶D对MEHP诱导的MOMP和INS-1胞凋亡的影响。结果:随着MEHP染毒浓度的增加,ROS生成量增加,氧化应激程度加深;LC3、p62、组织蛋白酶D、细胞色素c、caspase 9、caspase 3等相关蛋白表达上调;LMP、MOMP以及凋亡均显著增加。而PQQ作用之后,以上指标均有明显的改善;加入NAC之后,自噬的标志蛋白LC3和p62的表达下调,LMP和组织蛋白酶D的释放下降,MOMP和细胞色素c的释放减少,凋亡的标志蛋白caspase 9和3的表达下调,TUNEL显示细胞发生凋亡情况也得以缓解。在经过3MA和pepstatin A预处理后,相关的检测指标也均得到明显改善。结论:MEHP可通过氧化应激-溶酶体线粒体轴诱导INS-1细胞发生自噬依赖性的细胞凋亡,而PQQ可降低氧化应激水平通过溶酶体线粒体轴来抑制自噬依赖性的细胞凋亡。