细胞内pH在细胞增殖、凋亡、离子转运、内吞、多药耐药等多种生理过程中起着关键作用。细胞pH值的异常往往和细胞非正常的功能、增殖和生长相关。对癌细胞及其微环境中pH值的失调在促进癌细胞生存、增殖、侵袭、转移、耐药和凋亡的快速发展等方面的研究,有助于发现新的治疗目标并设计与pH相关的疾病治疗策略。监测肿瘤细胞中pH值可以指导靶向药物的设计、使装载的小分子药物在肿瘤酸性pH环境刺激下在其内部定点释放。荧光纳米传感器具有良好的时间和空间分辨率,是测量溶液或活细胞pH值的有效工具。与单荧光发射相比,采用比率荧光法可以有效消除激发强度、荧光团浓度和光散射的波动等因素造成的干扰,提高分析结果的可靠性。然而,传统比率荧光纳米传感器上两种荧光组分的比例无法精确固定,不同批次荧光传感器需要分别测定其校准曲线。频繁标定不同批次的纳米传感器的标准曲线需要耗费大量时间和精力,极大降低了检测效率。这使得采用纳米传感器作为系统和长期的研究手段对细胞内代谢物离子浓度的测量受到一定限制。针对上述问题,我们设计并制备了一种荧光团比例固定的新型pH比率荧光纳米传感器,该传感器对pH值的有效测量范围为5-7.6,不同批次传感器可以共用一条标准曲线,避免反复标定,从而大大提高研究效率。本研究分别合成了氨基荧光素与罗丹明B-乙二胺分子,并将两者按1:1的比例结合,制备出一个对pH敏感的双发射复合荧光分子。利用质谱、核磁共振波谱和红外光谱等检测方法对所合成的荧光分子进行结构确证。并通过紫外-可见光谱和荧光光谱对所合成的分子光学性能进行测定。将该双荧光分子偶联到聚丙烯酰胺纳米球上,制备出两种荧光团比例固定的pH比率荧光纳米传感器,并考察不同荧光分子浓度对不同批次纳米传感器性能的影响,绘制荧光纳米传感器测定缓冲溶液pH值的标准曲线。结果表明,通过制备荧光比例始终固定的纳米传感器可以实现不同批次传感器标准曲线一致性。采用origin软件对得到的曲线进行logistic拟合,得到荧光强度比值R与pH关系的拟合方程,拟合度可达0.9994。制备的比率荧光纳米传感器具有良好的生物相容性,实验结果表明,本研究制备的新型比率荧光pH纳米传感器可用于准确测量HeLa细胞内pH值,且传感器性能稳定。