在病毒、原核、真核生物中,都包含有DNA聚合酶,它是DNA复制过程中较为重要的酶。噬菌体作为病毒,在其侵染宿主细菌、进行增殖的过程中,以及在噬菌体自身的DNA复制过程中,都有DNA聚合酶的参与,并起到至关重要的作用。然而,我们对于噬菌体中的DNA聚合酶的认知是有限的,许多噬菌体中的DNA聚合酶的工作机理我们并不清楚,很多潜在的功能还待挖掘。对于较为复杂的真核生物来说,DNA聚合酶在其机体的正常运转与生命延续中也承担了重要的角色,对于自身基因的变异和外界环境的刺激影响,DNA聚合酶都能够辅助机体继续完成DNA复制、跨损伤与修复,它是生命遗传物质DNA进行精确复制的保障。生命体中许多疾病都与遗传基因DNA的损伤相关,DNA损伤会造成DNA序列永久性的改变,从而产生疾病,导致遗传特征的改变、功能丧失、畸形甚至死亡。机体本身会有自发性的变异,致使DNA复制时发生错配、碱基发生改变等;同时在自然界中接触到的物理性、化学性致损伤因素,也会导致DNA序列以及碱基发生突变,例如紫外线、电离辐射、烷基化试剂等等。DNA损伤所导致的疾病严重危害着人类的健康,通过研究DNA跨损伤复制以及修复等的机理,将为相关疾病的治疗奠定基础。铜绿假单胞菌噬菌体(Pseudomonas aeruginosa phage)PaP1作为一种新型的强制病性菌噬菌体,它的DNA聚合酶参与DNA复制的机理尚未研究,本课题组通过分离纯化PaP1噬菌体,构建载体,表达纯化PaP1噬菌体的DNA聚合酶Gp90,应用生物信息学对这种DNA聚合酶的功能进行预测,并通过实验完成功能的验证。同时,本课题组也对真核生物酵母的DNA聚合酶催化结构域Polηcore进行研究,分析其通过O6-MeG DNA损伤的动力学过程。研究的内容和结果如下:1.噬菌体PaP1的DNA聚合酶Gp90的功能鉴定:通过对gene 90进行片段扩增,连接到表达载体上,转化到大肠杆菌中,大量表达目的蛋白Gp90,裂解菌体后,超速离心,通过Ni柱纯化蛋白,得到具有酶活性的DNA聚合酶Gp90。PaP1噬菌体的DNA聚合酶Gp90属于A-类DNA聚合酶,它同时具有聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性。采用生物信息学方法对Gp90的功能进行了预测,并与同类的其它DNA聚合酶在聚合酶区域和外切酶区域分别进行了功能比对,发现Gp90的序列与其它A-类DNA聚合酶(例如T7 DNA Pol和E.coli DNA PolI)具有同源性但并不完全一致。通过同位素标记DNA的方法检测了DNA聚合酶和外切酶活性。聚合酶活性的检测采用双链DNA全长延伸反应、M13长链DNA的延伸反应、单点插入实验,发现Gp90可持续进行DNA复制,具有较高的延伸性,并且其DNA延伸能力与单个dNTP插入效率都类似于T7 Pol/trx。采用单链DNA和双链DNA验证外切酶活性,发现Gp90能够从3’到5’方向剪切单链DNA和双链DNA,与T7 Pol/trx的速率相似,但低于T7 Pol/trx的效率。最后,优化并确定Gp90聚合反应的最佳反应条件为:40 m M Tris–HCl(p H 8.0),30 m M MgCl2,200 m M NaCl,反应温度为37℃。这些关于PaP1 DNA聚合酶的发现都有利于我们增强对噬菌体中所编码的DNA聚合酶的认知,同时也增强理解PaP1感染铜绿假单胞菌的增殖过程。2.酵母菌的DNA聚合酶催化结构域Polηcore跨过O6-MeG损伤的动力学分析:选择Polη的催化结构域Polηcore,检测其通过O6-MeG DNA损伤的动力学过程。与全长DNA聚合酶Polη(残基1-632)相比较,Polηcore仅含有N端1-513个氨基酸,缺少参与蛋白相互作用的C端C2H2结构域,因此更能体现出该聚合酶通过DNA损伤的本征活性。首先采用四种dNTP存在下的全长延伸反应、稳态单个dNTP插入反应和下一位碱基的延伸反应、稳态前dCTP的插入反应以及液相色谱串联质谱技术分析所有延伸产物的序列。Polηcore催化下,在正常G上的错配率为10-4,在O6-MeG上的错配率为0.055-0.446。O6-MeG并不影响下一位碱基的延伸效率。在G与O6-MeG上插入dCTP时没有出现快速动力学过程,说明dCTP插入过程中的化学反应步骤不会快于随后的DNA和聚合酶解离的速率。当遇到O6-MeG时,引物的延伸被显著阻断,大约有67%的d TTP,31%的dCTP和2%的dATP插入到O6-MeG的对位。这些研究为深入理解酵母菌DNA聚合酶在跨过烷基化损伤时的分子机制提供了重要价值。