研究背景霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病,以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征。自19世纪以来,霍乱弧菌已经在世界范围内引起了七次霍乱大流行,波及100多个国家和地区,给人民的生命财产造成巨大损失。霍乱主要通过水、食物、生活接触等途径传播,霍乱病人的排泄物、呕吐物和受污染的衣物往往直接排入就近的河水中,下游的人们常常因为饮用生水,或者用生水洗刷食物、食具而引起霍乱的流行或暴发。在一些经济和卫生服务条件比较落后的发展中国家,几乎每年都有霍乱弧菌散发或局部暴发的报道。霍乱目前仍然是威胁发展中国家人民健康的主要公共卫生问题。新中国成立以来,尤其是进入二十世纪九十年代以来,我国的爱国卫生运动和农村改水改厕工作卓有成效,霍乱弧菌通过水源传播的情况得到了极大的改善和控制。但是,近年来,因生食或半生食受霍乱弧菌污染的海产品、肉、蔬菜而引起的食源性暴发时有发生,霍乱目前仍然是我国一类防控的肠道传染病。霍乱发生的早期,及时补液和敏感抗生素的应用是治疗霍乱非常有效而简单的方法。早期补液能够快速补充丢失的体液,恢复循环血量；在疾病急性期根据抗生素药敏试验选用敏感药物可以缩短腹泻的持续时间和排菌期,降低疾病严重性和缩短霍乱的传染期。然而,随着抗生素在临床的广泛应用,甚至是滥用,霍乱弧菌的耐药情况越来越严重。有研究报道,霍乱弧菌对治疗霍乱的几种传统抗生素(如四环素、氯霉素、青霉素、链霉素)已高度耐药,不宜再用于临床治疗,这无疑给霍乱临床合理用药提出挑战。因此,加强霍乱弧菌药物敏感性的监测,可以为霍乱的临床针对性用药,减少耐药菌株的产生,以及防控霍乱的暴发流行提供科学依据。广东省是中国最早有霍乱病例记载的省份之一,也是我国霍乱的流行高发地区。据历史资料记载,早在1817年,霍乱便由印度经曼谷传入中国的香港、澳门、广州等地,自此至1947年止的100多年间,在广州、汕头、北海、海南等沿海地区发生了近百次大小流行。1961年7月,引起第七次霍乱世界大流行的01群E1 Tor型霍乱弧菌在广东省阳江市首次暴发,成为我国01群El Tor型霍乱弧菌流行的起源地。至2013年止,广东省霍乱累计发病79386例,死亡1942人。因此,研究广东省霍乱弧菌的耐药情况对我国的总体耐药情况有参考和代表性意义。本研究拟对广东省1961-2013年50多年来从霍乱病例中分离的01/0139群霍乱弧菌485株,其中O1群360株,0139群125株,进行最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)抗生素敏感性试验,以此了解我省01/0139群霍乱弧菌的总体耐药表型特征,并比较分析不同年代分离的01/0139群霍乱弧菌之间的耐药表型的差异；分析菌株的多重耐药情况,并对多重耐药严重的菌株进行耐药相关可移动遗传元件(整合子和SXT)、耐药基因PCR检测和脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分子分型,以期深入分析这些多重耐药菌株的分子特征和菌株间的遗传关系,为进一步分析我省01/0139群霍乱弧菌多耐药菌株产生的分子机理,以及指导霍乱临床合理用药和防治提供实验依据。研究目的1.了解1961-2013年50余年来广东省O1/0139群霍乱弧菌的总体耐药表型特征,分析不同时期分离的霍乱弧菌的耐药表型差异,为霍乱病例的临床合理用药提供实验依据；2.分析菌株多重耐药表型特征,并对多重耐药菌株进行耐药相关可移动遗传元件(整合子和SXT)和耐药基因检测,了解其分布特征,对多重耐药菌株的耐药机制进行初步探讨;3.探讨多重耐药菌株间的遗传相关关系,为多重耐药霍乱菌株的防控和溯源提供基础数据。研究方法1.菌株来源：实验菌株为1961-2013年间广东省疾控中心从全省各地市收集分离保存的01/0139群霍乱病例菌株,来源于广东省疾病预防控制中心微生物检验所菌种库。2.研究方法：应用分层随机抽样方法抽取实验菌株；微量肉汤稀释法检测菌株耐药表型；多重PCR方法检测整合子、SXT元件和相关耐药基因；PFGE分型技术探讨菌株间的遗传相关性。研究内容1.通过文献调研的方式查阅1961年以来广东省霍乱流行史料,并根据霍乱监测资料和流行特征,将1961年以来广东省霍乱流行分为4个时期,根据不同流行时期,随机选择流行背景清楚、代表性好的01/0139群霍乱弧菌菌株485株,其中O1群360株,0139群125株,对其进行复苏鉴定和血清分型；2.对所选的01/O139群霍乱弧菌代表菌株进行最小抑菌浓度(MIC)耐药表型检测、耐药表型特征分析和多重耐药特征分析,分析不同时期分离菌株的霍乱弧菌的耐药特点和耐药变迁情况；3.根据菌株耐药表型特征,选择多重耐药(对三种或三种以上抗生素耐药)菌株,检测相关可移动遗传元件(Ⅰ-Ⅳ类整合子和SXT)、耐药基因和菌株PFGE分子分型,探讨广东省不同年代耐药基因携带情况和菌株间的遗传关系。研究结果1.360株Ol群试验菌株对头孢曲松和头孢吡肟100%敏感,对亚胺培南、环丙沙星、多西环素、氯霉素、阿奇霉素、庆大霉素、萘啶酸、氨苄西林、阿莫西林和四环素等10种抗生素的耐药率均在10%以下；菌株对头孢西丁、甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑的耐药率上升,分别为13.3%,14.7%,24.4%；菌株对链霉素耐药率最高,85.3%的菌株出现耐药。不同时期分离菌株的耐药特征分析显示,1961-1990年期间分离的菌株对萘啶酸、四环素、甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑均未出现耐药,然而从1991年开始,分离的菌株对这四种抗生素的耐药率呈快速增加趋势,特别是磺胺甲恶唑,90年代耐药率已高达74.6%。链霉素的耐药率在60年代开始即高达78.1%,此后一直保持高耐药率,2001年以来耐药率增加到94.6%。2.125株0139群霍乱弧菌试验菌株均为未见对头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南和环丙沙星耐药；菌株对头孢西丁、阿奇霉素、多西环素、阿莫西林、庆大霉素的耐药率在20%以下,分别为7.2%,12.0%,15.2%,19.2%,20.0%；菌株对氨苄西林、四环素和萘啶酸出现了一定程度耐药,耐药率分别为34.4%,35.2%和37.6%；然而,菌株对甲氧苄氨嘧啶、磺胺甲恶唑和链霉素耐药最严重,耐药率分别为67.2%,75.2%,89.6%。3.O1群和0139群霍乱弧菌多重耐药特征分析结果显示,O1和0139群菌株多重耐药率分别为25.9%,76.8%,0139群菌株的多耐率明显高于O1群(p<0.01)。01群可分出36种不同耐药谱,其中有2株同时对9种抗生素耐药,耐药谱为FOX+GEN+AMP+TMP+SMX+NAL+STR+AZI+AMX; O139群可分出46种不同耐药谱,其中有6株同时对10种抗生素耐药,耐药谱为TET+GEN+AMP+CHL+TMP+SMX+NAL+STR+AZI+AMX。两种血清群菌株不同流行期多耐率比较差异有统计学意义(p<0.05),随着时间变化,多耐率呈升高趋势。4.耐药基因检测结果显示,I类整合子在O1和0139两种血清群菌株中的阳性率分别为33.7%、22.9%；Ⅳ类整合子的阳性率分别为81.4%、71.9%。Ⅱ类和Ⅲ类整合子均未检测到。57.0%的O1群和60.4%的O139群霍乱弧菌多重耐药菌株携带SXT元件。dfrA1只特异地存在于O1群菌株中,而dfrl8只特异地存在于O139群菌株中,分别介导甲氧苄啶嘧啶的耐药；strA, strB(介导链霉素耐药),sulⅡ(介导磺胺甲恶唑耐药)和floR(介导氯霉素耐药)等四种耐药基因均广泛分布于O1群和O139群多重耐药菌株中。5. PFGE分型结果显示,86株O1群耐药菌株可分为65个型别,PFGE条带相似度为66.0%-100%；96株O139群耐药菌株可分为74个型别,PFGE指纹图谱相似度为69.3%-100%。具有相同耐药谱的多重耐药菌株菌株PFGE指纹图谱不完全一致,而具有相同PFGE图谱的菌株其耐药谱不完全一致,多耐严重(对9种以上抗生素耐药)具有相同耐药谱的菌株,PFGE图谱差异较大。可见PFGE图谱与耐药谱之间无明显相关性,提示PFGE型别存在明显遗传多样性,多耐药的O1/O139群霍乱弧菌在我省广泛存在。研究结论1.广东省O1/O139群霍乱弧菌对头孢曲松、头孢吡肟、亚胺培南、环丙沙星的敏感率较高,可作为在临床上治疗霍乱病人的首选药物；此外O1/O139群霍乱弧菌对链霉素、甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑耐药严重。2.广东省霍乱弧菌的多重耐药率逐渐升高,在1990年之前,多耐率为8.8%,1990年后,多耐率高达58.6%；耐药谱也随着年代的推移在不断变化和增宽,提示应改善多耐药菌株产生的环境和条件,继续加强对霍乱弧菌耐药抗生素和耐药谱的监测。3.Ⅰ类、Ⅳ类整合子和SXT元件及其携带的耐药基因在多重耐药O1/O139群霍乱弧菌菌株中广泛存在,提示菌株多重耐药性可能与其获得并携带了耐药基因的有关,因此应该注意加强多重耐药菌株中耐药基因的检测和分析,密切注意耐药基因在不同菌群间的传播和扩散,及时发现耐药基因的变异,或新耐药基因的出现。4.广东省多重耐药菌株的PFGE型别多样,存在明显的遗传多样性；耐药谱相同的多重耐药菌株,PFGE图谱并不完全一致,提示广东省多重耐药的霍乱弧菌菌株在我省广泛存在。