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树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),能够刺激初始T细胞活化,它可通过诱导产生CD8+细胞毒性T细胞(CTL)直接或间接杀伤肿瘤细胞来实现抗肿瘤的作用。程序性死亡配体-1(Programmed death ligand -1,PD-L1)是B7/CD28协同刺激因子超家族的重要成员,PD-L1与其受体PD-1(programmed death-1)相互作用可抑制T细胞的活化增殖和细胞因子的分泌,负调控免疫应答,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。本实验目的在于检测恶性胸水来源的DC上PD-L1的表达,从而研究DC与PD-L1对肺癌局部微环境胸水中T细胞的生物学功能的调节作用,初步探讨PD-1/PD-L1途径在肺癌免疫逃逸中的作用。第一部分结核性和恶性胸水中淋巴细胞亚群比例变化目的:比较结核性和恶性胸水中淋巴细胞亚群比例及IFN-γ含量。方法:结核性胸膜炎患者16例和恶性胸水患者22例,在治疗前采集胸水标本,离心收集细胞悬液,有核细胞计数、分类、流式细胞仪检测淋巴细胞亚群,检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比例,并计算CD4+T/ CD8+T比值,ELISA法检测胸水上清液中干扰素-γ( interferon-gamma, IFN-γ)含量。结果:结核性胸水中T辅助淋巴细胞以CD4+T细胞为主,其CD3+、CD4+T细胞比例(P < 0.01)以及CD4+T /CD8+T比值(P < 0.05)均高于恶性胸水组。两组研究对象IFN-γ的浓度分别是:结核性胸水组1140.16±266.82pg/ml;恶性胸水组31.49±22.36 pg/ml。结核性胸水IFN-γ水平明显高于恶性胸水(P < 0.01)。结论:结核性胸水表现为Th1免疫应答为主;而恶性胸水存在明显的细胞免疫功能低下。IFN-γ可作为鉴别结核性胸水和恶性胸水的指标之一。第二部分恶性胸水来源树突状细胞的诱导及其表面PD-L1的表达目的:研究恶性胸水来源DC表面PD-L1的表达。方法:双层Ficoll密度梯度离心法获得胸水单个核细胞,CD14阳选磁珠分选出DC前体细胞,即单核巨噬细胞,在单核巨噬细胞中加入粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)进行体外培养。应用光镜观察细胞形态;用流式细胞仪对DC进行表型鉴定。同种方法培养外周血单个核细胞。结果:肺癌恶性胸水中的单个核细胞经CD14阳性磁珠分离选择,获取CD14+细胞,经流式细胞仪检测细胞纯度在90%以上。体外经GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导,可培养为成熟DC。所获DC显示其特有的毛刺状突起,高表达CD80(90.3±5.7%)、CD83(73.8±6.9%)、HLA-DR(94.4±2.8%),中度表达CD1α(31.5±6.0%),且高度表达PD-L1(92.9±4.3%) ,与正常人外周血来源的DC相比,差异无统计学意义(P >0.05)。结论:恶性胸水中的前体细胞体外培养可获得具备正常形态、表型的成熟DC,体外培养成熟的DC高表达PD-L1。第三部分树突状细胞表面PD-L1分子对恶性胸水中T细胞生物学功能的调节作用目的:探讨高表达PD-L1的DC对肺癌恶性胸水T细胞生物学功能的调节作用。方法:收集培养成熟的DC、复苏冻存的胸水T淋巴细胞,将DC和T细胞按1:10的比例混合反应,设实验组:T+PHA组、T+PHA+DC组、T+PHA+DC+PD-L1MAb组及T细胞组。共培养3天, MTT法检测T细胞的增殖效应,ELISA法检测T细胞分泌IFN-γ的水平,流式细胞术分析T细胞表型。结果:刺激细胞/效应细胞按1:10的比例混合反应,与T+PHA组比,T+PHA+DC组的T细胞增殖明显[(0.191±0.078)vs (0.372±0.065),P<0.01], IFN-γ的分泌水平增高[(135.45±9.47) pg/ml vs (342.16±42.74) pg/ml,P<0.01]。T+PHA+DC组与T+PHA+DC+PD-L1MAb组相比,T+PHA+DC+PD-L1MAb组T细胞增殖显著[(0.372±0.065) vs (0.536±0.144),P<0.05],IFN-γ的分泌水平更高[(342.16±42.74)pg/ml vs (507.56±57.89) pg/ml,P<0.05]。各实验组CD25的表达无明显差异。T+PHA+DC+PD-L1MAb组与T+PHA组比较,CD69增高16%(P <0.05),与T+PHA+DC组相比无差异。结论:高表达PD-L1的DC可刺激T细胞的增殖与活化,当封闭PD-L1分子后,DC刺激T细胞的功能增强。进一步证明PD-1/PD-L1途径对肺癌恶性胸水中T细胞的功能具有负性调节作用。