棉铃虫是一种多食性害虫,具有很强的繁殖能力和迁飞能力,并且可以兼性滞育,这些生物学特性使得棉铃虫成为抗药性发生最严重的农业害虫之一。上世纪90年代由于化学杀虫剂的广泛使用,棉铃虫抗药性发展迅速,最终导致其在我国北方棉区大暴发,造成了巨额的经济损失。我国自1997年开始推广种植表达CrylAc毒素蛋白的Bt棉花,到2011年Bt棉花种植面积已占棉花总种植面积的71.5%。Bt棉花的大规模种植有效控制了棉铃虫的为害,减少了化学杀虫剂的使用,而且提升了农业生态系统的生物防治功能,带来了明显的经济、环境和社会效益。Bt棉花的大规模种植使得棉铃虫长期承受Bt毒素的选择压力,必将导致棉铃虫对Bt毒素的抗性演化,从而严重影响Bt棉花的使用寿命。Bt棉花在我国已连续种植了15年,我国没有采用种植一定比例非Bt棉花的庇护所策略,因此迫切需要明确我国棉铃虫田间种群Bt抗性的现状。室内筛选的棉铃虫CrylAc抗性品系通过钙粘蛋白缺失突变产生高水平抗性,棉铃虫田间种群中是否也存在基于钙粘蛋白的抗性等位基因?是否还有其他类型的抗性基因?在解释Bt毒素作用机制的两种模型中,钙粘蛋白均为重要的Bt受体,但是钙粘蛋白的胞外区和胞内区如何发挥作用还不清楚。本文针对我国Bt棉花生产中的关键问题和Bt毒素作用机理中的核心环节开展了系统研究,发现了Bt棉花的大规模种植导致我国北方棉区棉铃虫种群产生了早期抗性,揭示了棉铃虫田间种群Bt抗性基因的遗传多样性,并明确了棉铃虫钙粘蛋白胞质区突变导致对CrylAc产生非隐性抗性的分子机理。本文的研究结果对于开发高效的棉铃虫Bt抗性监测技术,制订针对性的抗性治理策略和措施,以及完善Bt作用机理的理论模型均具有重要意义。1.棉铃虫田间种群对Bt毒素CrylAc敏感性水平的检测已有研究表明,在1997年种植Bt棉花之前的新疆和北方棉区(部分长江中下游棉区和部分黄河流域棉区)棉铃虫种群对CrylAc的敏感性没有显著差异。1997至2010年间,Bt棉花在北方棉区的种植强度显著高于新疆棉区。为了明确我国棉铃虫CrylAc敏感性的现状,对2010年采自我国新疆棉区和北方棉区共15个棉铃虫种群对CrylAc的敏感性进行了检测。新疆棉区的沙湾和莎车种群与室内敏感品系SCD对CrylAc活化毒素的LC50间没有显著性差异,而北方棉区的安阳种群对CrylAc活化毒素的LC50值最高,为沙湾种群的16倍。北方棉区13个棉铃虫种群对CrylAc活化毒素LC50的平均值(52ng cm-2)是新疆棉区2个种群LC50平均值(18.5ngcm-2)的2.8倍。与CrylAc活化毒素的监测结果一致,北方棉区13个棉铃虫种群对CrylAc原毒素LC50的平均值(80ng cm-2)是新疆棉区2个种群LC50平均值(26.5ng cm-2)的3倍；安阳种群对CrylAc原毒素的LC50值最高,是莎车种群的10倍。利用1000ng/cm2的CrylAc活化毒素作为诊断剂量对这15个地理种群抗性个体频率进行了检测。对北方棉区13个种群11064头幼虫进行测定,抗性个体频率为1.3%；对新疆棉区2个种群1296头幼虫和室内敏感品系168头幼虫分别进行了测定,均未检测到抗性个体。LC5o值最高的安阳种群抗性个体频率也最高(2.6%)。上述检测结果表明,Bt棉花的密集种植导致我国北方棉区的部分棉铃虫种群对CrylAc产生了早期抗性。尽管Bt棉花在田间还没有失去防治效果,我们应该尽早采取针对性抗性治理措施来延缓棉铃虫Bt抗性的发展。2.棉铃虫田间种群Bt抗性基因的遗传多样性采用F1筛选法对2009年采自山东夏津田间棉铃虫CrylAc抗性等位基因进行检测,并对田间抗性基因的显隐性进行了鉴定。在与SCD-rl抗性品系杂交的146个单对系中,有28个单对系的田间父本携带1个抗性等位基因,有3个单对系的父本携带2个抗性等位基因,统计分析表明2009年夏津棉田棉铃虫CrylAc的抗性基因频率为0.116(95%置信区间0.083-0.160)。通过F1代存活个体与室内敏感品系SCD进行杂交,利用杂交后代在CrylAc诊断剂量下的存活率鉴定田间抗性基因的显隐性。结果表明田间种群基于钙粘蛋白的隐性抗性基因频率达80%,而非隐性抗性基因频率为20%；但是抗性个体中携带非隐性抗性基因的比例高达73%-84%。因此,在棉铃虫Bt抗性监测与抗性治理中必须重视非隐性抗性的作用。为了进一步明确棉铃虫田间种群Bt抗性基因的遗传多样性,将2010年棉铃虫田间种群在CrylAc诊断剂量下存活个体分别与SCD敏感品系单对杂交,对其后代筛选后分别建立抗性品系,并对各抗性品系Bt抗性基因类型进行鉴定。在筛选到的12个棉铃虫田间抗性品系中,5个品系携带基于钙粘蛋白突变的隐性抗性基因,7个品系携带非隐性抗性基因；在携带非隐性抗性基因的7个品系中,有6个携带基于钙粘蛋白突变的抗性基因,1个携带非钙粘蛋白的抗性基因。该结果进一步表明,棉铃虫可以通过多样化的遗传途径对Bt产生抗性,且从田间种群中分离得到的大部分抗性个体携带非隐性Bt抗性基因。本研究揭示了棉铃虫田间种群对Bt棉花的抗性基因存在遗传多样性,发现并证实非隐性抗性基因在Bt作物抗性演化中具有关键性作用。针对我国棉铃虫Bt抗性的现状,建议同时采用基因叠加和自然庇护所策略,以延缓Bt抗性发展。3.棉铃虫钙粘蛋白胞质区缺失突变导致Cry1Ac非隐性抗性目前所发现的Bt抗性相关的昆虫钙粘蛋白基因均为胞外区氨基酸缺失或翻译提前终止,尚未发现与Bt抗性相关的胞质区突变。我们从棉铃虫夏津田间种群中通过F1筛选获得1个独特的钙粘蛋白抗性等位基因r15(胞内区缺失55个氨基酸),并建立了钙粘蛋白胞质区缺失突变纯合品系XJ-r15。遗传分析结果表明XJ-r15对Cry1Ac的抗性是非隐性、常染色体遗传,并且突变基因r15与棉铃虫Cry1Ac非隐性抗性紧密连锁。Western-blot和配基结合试验表明r15在XJ-15中正常表达,并能够与Cry1Ac毒素结合。在Sf9细胞系中表达了4种钙粘蛋白基因：敏感基因s,抗性基因r15,以及含有胞质区突变的嵌合基因s/r15和不含胞质区突变的嵌合基因r15/s。免疫荧光定位分析显示这四种基因都能够在Sf9细胞膜上表达,并且都能与Cry1Ac结合。细胞毒力测定结果显示,Cry1Ac能够对这四种表达棉铃虫钙粘蛋白的细胞产生毒杀作用,但是感染r15重组病毒的Sf9细胞对Cry1Ac毒素的LC50及其95%置信限为85nM (71nM-110nM),感染s/r15重组病毒的Sf9细胞的LC50及其95%置信限为82nM (68nM-100nM),二者之间没有显著性差异。而感染s重组病毒和r15/s重组病毒的细胞对CrylAc毒素的LC50及其95%置信限分别是38nM (31nM-46nM)和38nM (31nM-45nM).该结果表明,棉铃虫钙粘蛋白胞质区突变能够使Cry1Ac毒力显著降低,钙粘蛋白胞质区在Cry1Ac作用机制中发挥重要作用。本研究结果阐明了棉铃虫钙粘蛋白胞质区突变导致Cry1Ac非隐性抗性的分子机理,证实了棉铃虫钙粘蛋白的胞内区和胞外区共同参与Cry1Ac的毒杀作用,从而完善了现有的Bt毒素作用机理的理论模型。