【摘 要】
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本研究以猴头菇多糖（HEP）为原料,采用乳化-溶剂挥发法制备纳米猴头菇多糖微粒（HEP-PLGA-NPs）。并以包封率为考察指标,利用响应面法优化制备纳米猴头菇多糖微粒的工艺,得到包封率最高的纳米微粒。选取Caco-2细胞为研究对象,并使用Transwell 12孔板构建小肠上皮模型。采用MTT法筛选出HEP和HEP-PLGA-NPs的安全浓度,比较不同加药时间、不同浓度的HEP和HEP-PLGA
【基金项目】
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国家自然科学基金（XJQ201604）； 省自然基金（KJd16057A、KFA17232A）；
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本研究以猴头菇多糖（HEP）为原料,采用乳化-溶剂挥发法制备纳米猴头菇多糖微粒（HEP-PLGA-NPs）。并以包封率为考察指标,利用响应面法优化制备纳米猴头菇多糖微粒的工艺,得到包封率最高的纳米微粒。选取Caco-2细胞为研究对象,并使用Transwell 12孔板构建小肠上皮模型。采用MTT法筛选出HEP和HEP-PLGA-NPs的安全浓度,比较不同加药时间、不同浓度的HEP和HEP-PLGA-NPs在肠上皮细胞上的吸收,并考察不同环境温度下HEP-PLGA-NPs在肠上皮细胞上吸收的影响。通过Western Blot技术检测P-糖蛋白的表达,并用流式细胞仪探索经HEP和HEP-PLGA-NPs处理后的Caco-2细胞摄取罗丹明123的影响。实验结果如下:（1）通过响应面法优化猴头菇纳米微粒制备工艺,得到最佳的制备条件:有机相和内水相之比为8.35,外水相与初乳之比为7.24,PLGA浓度为23.52 mg/mL。在此条件下制备的HEP-PLGA-NPs包封率理论值为91.81%。扫描电镜和透射电镜结果显示,微粒呈球形,表面光滑圆整,粒子之间无粘连现象,分散性良好。Zeta电位和粒度分布仪检测结果显示,粒径为184.5±11.98 nm,Zeta电位为-28.33±0.186 mV。（2）Caco-2细胞模型培养至第21天时,显微镜下观察可见细胞生长紧密,形态完好。可初步断定Caco-2细胞模型建立成功。并通过检测AP侧碱性磷酸酶活力和BL侧碱性磷酸酶活力,结果显示AP侧碱性磷酸酶活力为BL侧的5.11倍,表示可AP侧与BL侧的碱性磷酸酶活力出现明显极性差别。经过21天培养分化后,TEER值为507±23.07Ω。酚磺酞透过率随着培养时间逐渐减小,至14天时透过率为0.60%,之后降低缓慢,趋于平稳,至21天时可认为已形成足够紧密的单层结构。（3）采用MTT试验测定HEP和HEP-PLGA-NPs的浓度在0.2-100 μg/mL内对Caco-2细胞无细胞毒性。在安全浓度内,取25、50、100 μg/mL进行后续试验。不同加药时间里,HEP与HEP-PLGA-NPs的转运量呈时间依赖性,且相对应的时间点HEP-PLGA-NPs组的Papp值都会显著大于HEP组。25、50、100μg/mL HEP与HEP-PLGA-NPs的PDR<1.5,相对应剂量的HEP的PDR 大于 HEP-PLGA-NPs 的 PDR。在 37℃和 4 ℃环境下,25、50、100 μg/mL HEP-PLGA-NPs在Caco-2细胞模型上的吸收都呈剂量依赖性,在37℃的环境下的Papp值显著高于4℃的Papp值。（4）Western Blot 法结果显示 HEP 与 HEP-PLGA-NPs 都显著增加了 P-gp蛋白的表达量（P<0.01）。HEP的浓度与P-gp蛋白表达量呈现显著的正相关性（P<0.01）;HEP-PLGA-NPs的浓度与P-gp蛋白表达量呈现显著的负相关性（P<0.01）。流式细胞术结果显示,HEP-PLGA-NPs组的平均荧光强度大于HEP组,且HEP-PLGA-NPs的浓度与平均荧光强度呈正相关性。以上的结果表明,采用响应面法优化乳化-溶剂挥发法所制备的HEP-PLGA-NPs粒径小、分布均一、包封率高、稳定性好。HEP-PLGA-NPs的转运量呈时间依赖性,浓度依赖性和能量依赖性。HEP与HEP-PLGA-NPs的吸收都以被动转运为主,并且存在膜蛋白介导主动转运过程。通过纳米化可有效增加HEP在Caco-2模型上摄取和跨膜转运速率。HEP与HEP-PLGA-NPs都显著上调了 P-gp蛋白的表达,HEP 比HEP-PLGA-NPs更大程度上调P-gp蛋白表达量和外排功能,说明HEP-PLGA-NPs吸收优于HEP。
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