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第一部分MiR-31在SH-SY5Y细胞中的转录组测序分析背景与目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种进行加重的运动障碍性疾病。目前PD的病因不明确且无法根本治愈。本研究前期在患者和对照者血清中,通过Solexa测序、qRT-PCR技术筛选出了7个有表达差异的miRNAs,并且在脑组织的RNA提取液中进一步验证,最终得到具有统计学差异的miR-31。本部分研究继续以上研究,探索miR-31在人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中的功能及参与的信号通路,为miR-31在PD中的深入研究提供理论基础。方法:取对数生长期的SH-SY5Y细胞,在SH-SY5Y细胞中,分别转染miR-31mimic、miR-31 inhibitor、miR-NC mimic及miR-NC inhibitor。通过RNA-seq技术对分别4组SH-SY5Y细胞进行深度转录组测序。采用R软件对细胞内差异基因表达、差异基因的GO功能、Pathway功能和转录因子家族进行分析。结果:1)结果显示841个基因出现上调,1268个基因出现下调。2)GO分析结果显示,差异基因参与细胞处理、代谢、过程,生物调节、构成细胞组分、蛋白结合等过程。3)Pathway分析表明,差异基因大都分布在信号转导、信号分子和相互作用、肿瘤形成、病毒感染性疾病、代谢、免疫系统、内分泌系统等通路中。其中67个差异基因参与细胞增殖与死亡通路。结论:miR-31具有重要生物学功能,参与细胞中的信号转导、细胞增殖与死亡、肿瘤形成、免疫、代谢等1信号通路,为miR-31的研究提供初步基础。第二部分Mi R-31在帕金森病中的功能研究及其机制探索背景与目的:探讨mi R-31在PD中的功能及其具体机制。方法:首先用不同浓度的MPP+溶液处理人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),构建急性PD细胞模型;通过流式细胞技术探讨mi R-31对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响;然后通过生物信息学技术预测mi R-31的靶基因。并利用Western blot和q RT-PCR技术在细胞内检测预测靶基因m RNA和蛋白的表达水平。根据结果筛选出最可能靶基因,然后通过双荧光素酶报告基因实验验证mi R-31是否直接结合SRSF11的3′UTR区。最后通过补救实验验证mi R-31是否通过调控SRSF11 m RNA表达影响细胞凋亡。结果:1)流式细胞实验和CCK8实验结果发现mi R-31对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用。2)生物信息学预测SRSF11是mi R-31的靶基因,并用q RT-PCR技术和Western blot验证mi R-31可调控SRSF11的m RNA和蛋白水平表达。3)双荧光素酶报告基因检测验证mi R-31可结合SRSF11的3′UTR区域从而抑制SRSF11的表达,mi R-31是SRSF11的直接靶基因。4)Rescue实验证明mi R-31、SRSF11对细胞凋亡的作用相反,均可调控Bax/Bcl-2 m RNA表达影响凋亡;mi R-31可结合SRSF11的3′UTR抑制其表达,逆转SRSF11过表达引起的细胞凋亡。结论:mi R-31可抵抗MPP+造成的SH-SY5Y细胞毒性作用,减少细胞凋亡,对细胞有保护作用;mi R-31通过结合SRSF11的3′UTR调控其表达,能抑制SRSF11的m RNA和蛋白水平表达;SRSF11是mi R-31的直接靶基因;mi R-31通过下调SRSF11表达,调节凋亡相关基因Bax/Bcl-2 m RNA表达抑制细胞凋亡。第三部分STK39、BST1基因单核苷酸多态性对中国人群帕金森病发病风险和运动症状进展的相关性研究背景与目的:STK39、BST1基因的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与白种人PD发病风险有关,而SNPs受种族,环境等多种因素影响。本部分研究旨在研究STK39、BST1基因的SNPs与亚洲中国人群PD病人的发病风险和病情进展的相关性。方法:本部分研究收集前来南京医科大学附属脑科医院PD门诊就诊的153名散发性PD患者。同时从南京体检中心收集性别年龄相匹配的健康对照者197名。由专业神经内科医师收集基本人群资料并评估PD统一评定量表第三部分(Unified Parkinsons′disease ratingⅢ,UPDRSⅢ)和第五部分Hoehn-Yahr(H-Y)分期,抽取病人静脉血5 m L备用。利用Mass ARRAY?SNP对所有研究对象STK39、BST1基因型进行分型。入组PD病人进行随访(平均随访年限大于2年),在随访点由同个神经内科医师再次评估PD量表。采用R软件的lme4软件包的混合线性模型和多重线性回归模型对基因型和PD发病风险和PD病情进展进行相关性分析。结果:1)BST1 rs4698412位点的单核苷酸多态性与PD发病有关,AA型是PD发病的危险因素。携带AA基因型的PD患者发病风险比对照组升高1.54倍。2)STK39 rs2390669位点的AA型与AG+GG型相比,运动症状进展明显加快。BST1 rs4698412位点、rs1931532位点的基因型与运动症状进展均无显著相关。UPDRS III的强直分和运动迟缓分均有STK39基因rs4698412位点基因型显著相关。STK39 rs2390669位点的AA基因型是PD运动症状进展加快的危险因素,可加快强直和运动迟缓症状的进展。结论:BST1 rs4698412位点的单核苷酸多态性与PD发病有关。STK39 rs2390669位点的单核苷酸多态性是PD病人强直和运动迟缓症状进展加快的危险因素。