基因打靶技术因其通过同源重组的方法整合进基因组，在转基因动物生产中可以定点的改造动物的遗传基因，克服了其它转基因方法中随机插入而引起的一系列问题。通用型基因打靶载体的构建为基因打靶技术的应用提供了便利，现已存在几种通用型基因打靶载体，但都存在打靶载体中酶切位点少及打靶成功后正选标记基因存在于基因组中等问题，这些问题的存在势必影响基因打靶技术的应用。为了解决现存通用型基因打靶载体中存在的问题，本研究构建了新型通用型基因打靶载体pA2TR，并对该载体的功能进行了验证研究。 一、普通型基因打靶载体pA2T的构建及功能研究本研究以克隆载体pGEM-3Z为骨架，插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo)、两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2，并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(1ocus ofcrossing-over(x)in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列，从而构建了载体pA2T。插入的两个不同的多克隆位点序列中，neo和HSV-tkl之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点，neo、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元。脂质体法转染山羊成纤维细胞，用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选，验证了正负选择标记基因的生物活性，证明通用型基因打靶载体pA2T构建成功。载体pA2T转化组成性表达Cre重组酶(cyclization recombinationprotein)的大肠杆菌BM25.8，检测LoxP序列的生物活性，结果表明pA2T中的正选基因可以被Cre重组酶去除。所以，本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T，根据不同的基因座设计同源臂后，插入到MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶，并能够在打靶成功后用Cre重组酶去除基因组中插入的neo基因，为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利。 二、Cre recombinase基因的克隆及表达研究为了应用Cre/LoxP系统去除打靶成功后的正选标记基因neo，本试验克隆了Crerecombinase基因，并且构建了该基因的原核和真核表达载体。原核表达后，并证实了Cre基因的生物活性。 三、小鼠Oct4基因启动子的克隆及功能研究本试验成功的克隆了小鼠Oct4基因启动子，并且在山羊成纤维细胞中分析了小鼠Oct4基因启动子的生物活性，证实小鼠Oct4基因启动子在体细胞中的确没有生物活性。 四、新型基因打靶载体pA2TR的构建及功能研究本试验将Oct4启动子和Cre recombinase片段插入所构建的基因打靶载体pA2T中，成功构建了新型的基因打靶载体pA2TR，并且证实pA2TR可以做为通用型基因打靶载体。