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胆囊癌是一种起源于胆囊上皮的恶性肿瘤。在消化系统恶性肿瘤中,胆囊癌发病率虽然不高,但具有恶性程度高、进展迅速的特点。胆囊癌常继发于慢性胆囊炎或胆囊结石,早期症状往往不明显,易被原发病掩盖,当出现明显临床症状时,往往已进展至中、晚期,大部分患者此时已失去了行根治性手术的机会。胆囊癌对放、化疗多不敏感。对于无法行根治性手术的胆囊癌患者,目前的治疗手段多采用姑息性手术治疗,其目的仅在于减轻或解除患者黄疸或十二指肠梗阻症状,无法延缓肿瘤进展。这类患者的预后较差,总生存期较短,3年生存率低于20%。肿瘤免疫学的建立将肿瘤的临床诊治与基础免疫研究紧密结合,对指导肿瘤的免疫治疗具有重要意义。随着研究者对机体免疫功能与肿瘤发生、发展相互关系研究的逐渐深入,目前,一系列的肿瘤免疫治疗方法已进入临床。以EGFR/HER为靶点的靶向抗体,如:西妥昔单抗、曲妥珠单抗在胆囊癌的免疫治疗中取得了一定的成效,但仍存在敏感性差、耐药率高等特点,一定程度上制约了免疫治疗在胆囊癌患者中的推广。以负性共刺激分子为靶点的免疫调节剂有望改善这一困境。负性共刺激分子,又称免疫检查点,主要通过抑制免疫细胞功能来下调免疫应答。B7家族被认为是导致肿瘤免疫逃逸的关键调节分子。已存研究表明,B7家族成员,如:PD-1、B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H7等免疫检查点分子,在多种肿瘤组织中呈异常表达,表达水平与患者预后相关。鉴此,研究胆囊癌组织中B7家族分子的表达规律及其临床意义对探讨胆囊癌的免疫治疗具有重要意义。本研究首先通过收集胆囊癌患者的肿瘤和癌旁组织病理切片,检测了 B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌和癌旁组织中的表达,发现这三个分子在胆囊癌组织中表达均上调。在此基础上,分析了这三个分子与相应临床病理特征以及相互表达间的相关性,初步探讨了三者在胆囊癌中表达的临床意义。然后,使用PBMC(外周血单个核细胞)和胆囊癌细胞株GBC-SD构建了共培养体系,加入阻断型抗体分别或联合阻断这三个分子。初步探讨胆囊癌细胞表达B7-H1、B7-H3及B7-H4对免疫细胞的负性调节作用。第一部分负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌中表达的临床意义目的:研究B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中的表达并分析其临床意义。方法:收集2014年10月至2017年6月期间苏州大学附属第一医院行手术治疗并经病理确诊的90例胆囊癌病理石蜡切片,记录患者年龄、性别、临床分期、病理分级等临床资料,同时收集其中20例的癌旁组织作为对照。免疫组化SP法检测胆囊癌组织和癌旁组织中B7-H1、B7-H3及B7-H4的表达。对比B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌以及癌旁组织中表达的差异性,并分析三者与临床病理参数间的相关性。结果:(1)B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中的阳性高表达率分别为:68.8%(62/90)、40.0%(36/90)、34.4%(31/90),而在癌旁组织中的阳性高表达率分别为:30%(6/20)、5.0%(1/20)、5.0%(1/20);B7-H1表达程度与胆囊癌有无远处转移相关,B7-H3表达程度与浸润深度、Nevin分期、AJCC临床分期、血清CA125水平及淋巴结转移呈正相关,B7-H4表达程度与肿瘤直径呈正相关;(2)B7-H1和B7-H4的表达呈正相关,B7-H3和B7-H4的表达呈显著正相关。Spearman相关性分析结果显示,B7-H3和B7-H4在表达上的关联性较B7-H1和B7-H4的关联更为显著。结论:(1)负性共刺激分子B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌组织中呈异常表达。B7-H1与胆囊癌远处转移相关,B7-H3与胆囊癌进展有一定关联性,而B7-H4参与胆囊癌原位生长。(2)B7-H1和B7-H4、B7-H3和B7-H4在表达上呈正相关。综合检测三者表达对评估患者预后有一定的临床意义。第二部分胆囊癌细胞表达的B7-H1、B7-H3及B7-H4对外周血淋巴细胞抑制作用的初步分析目的:比较胆囊癌细胞表达的B7-H1、B7-H3及B7-H4对PBMC的体外抑制作用及其阻断效应。方法:细胞免疫组化SP法及单标流式细胞术检测B7-H1、B7-H3及B7-H4在胆囊癌细胞株GBC-SD的表达。利用经丝裂霉素处理的GBC-SD与PBMC共培养以模拟胆囊癌免疫微环境。设立同型对照组、单分子阻断组、双分子联合阻断组及三分子联合阻断组。按组别分别或联合加入B7-H1阻断型抗体、B7-H3阻断型抗体或B7-H4阻断型抗体,CCK-8法测定各组吸光度。通过各组PBMC的计数变化,比较并分析B7-HI、B7-H3及B7-H4分子阻断的作用。结果:(1)细胞免疫组化及单标流式细胞术均显示B7-H1、B7-H3及B7-H4在GBC-SD细胞中表达;(2)阻断B7-H1、B7-H3及B7-H4分子中的任何一个均能增加共培养环境中PBMC细胞数,且组间对比结果显示,阻断B7-H3、阻断B7-H3和B7-H4或阻断B7-H1、B7-H3和B7-H4后PBMC细胞数增加显著。结论:(1)B7-H1、B7-H3及B7-H4分子在胆囊癌细胞的表达可介导显著的免疫负调控作用;(2)体外共培养实验显示,B7-H3分子阻断、B7-H3和B7-H4联合阻断及B7-H1、B7-H3和B7-H4联合阻断作用显著。B7-H3可能是胆囊癌免疫治疗的一个有效靶点。