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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,大型真菌是漆酶主要的生产菌株。对真菌漆酶的研究多在于生产菌株的筛选、培养条件优化、漆酶酶学性质和漆酶基因克隆方面,而对于真菌漆酶表达相关基因的功能和调节机制方面的研究较为薄弱。本研究通过克隆漆酶表达的相关基因,了解其对漆酶表达的影响,以初步了解真菌漆酶分泌调控机制,为今后漆酶基因的高效表达和漆酶的工业化生产提供科学理论依据。
漆酶的表达与菌株的培养条件关系密切。本研究设计四种不同的培养方式,运用cDNA—AFLP方法克隆TR16菌株漆酶差异表达的相关基因,得到79条TDFs。通过在NCBI上BLASTn和BLASTx比对,有63条TDFs与已知功能基因片断具有同源性。对所获得的63条TDFs可能的生物学功能进行分类,可分为以下7个功能组:与信号传导蛋白、表达调控蛋白、转运功能蛋白、代谢相关的蛋白、翻译后修饰蛋白、DNA修复蛋白和反转录转座子蛋白。这些已知功能基因的表达可能与漆酶诱导或阻遏的表达有关,也可能参与了漆酶表达的代谢机制。
为了进一步验证cDNA—AFLP结果的可靠性,通过运用半定量RT-PCR方法,选取了4条TDFs,分别为1号样差异基因片断41511(编码依赖于DNA的RNA聚合酶)、2号样差异基因片断4422(编码反转录转座子蛋白)、3号样差异基因片断41032(编码含转录阻遏子的氧化还原酶)、4号样差异片断6621(编码逆转录元件)和TR16漆酶基因片断进行分析,研究不同培养时间点(13d,15d,17d),各条基因片断在TR16中的表达模式和对漆酶基因表达的作用。实验结果表明4条TDFs和TR16漆酶基因片断分别在1号、2号、3号和4号培养条件下存在表达,基因片断41511和基因片断41032对TR16漆酶基因起较明显的上调作用,基因片断4422对TR16漆酶基因片断起较明显的下调作用,而基因片断6621对TR16漆酶基因片断的下调作用不太明显。这说明了4条TDFs参与了调控TR16号菌株漆酶的表达,表明了TR16漆酶的表达受到氮源和氧气的影响,并在DNA水平、转录水平及转录后水平进行调控。