肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内，尤其是亚洲和非洲发病率最高的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，预后极差。临床统计数据表明，全世界每年有 500-1,000 万新发病例，在亚洲以及非洲部分地区，每 10 万人口中约有 500 人罹患此病。出现症状的 HCC 患者，5 年生存率不到 5%，HCC 对放疗化疗均不敏感，目前包括手术为主的综合治疗方案亦难以显著改善预后。大多数研究认为，仅无临床症状的小肝癌，经过手术或非手术治疗，能获得相对较长的生存期。因此，针对进展期 HCC，寻找新的治疗方案迫在眉睫。目前，人们对 HCC 发病及其浸润转移机制已经有了较深入认识，随着现代分子生物学理论和技术的进步，诸如分子诊断、基因治疗、生物治疗等技术将成为临床攻克 HCC 的重要手段。近年来，针对恶性肿瘤的基因治疗或生物治疗，已经设计了多种方案。包括抑癌基因治疗、基因修饰瘤苗、免疫基因治疗、自杀基因治疗等。针对恶性肿瘤中有害基因的高表达，运用反义技术、核酶或新兴的 RNAi 技术(RNAinterference)，抑制甚至完全封闭有害基因已经显示了极具前景的应用价值。 4<WP=10>重庆医科大学博士学位论文 肿瘤临床治疗过程中，由于肿瘤细胞逐渐产生的对多种化疗药物极不敏感，成为化疗失败的主要原因。而 HCC 细胞中与化疗药物耐受相关基因的高转录、高表达成为 HCC 细胞耐药的主要原因。这些基因主要是多药耐药基因(multidrug resistance gene, mdr1)和多药耐药相关蛋白基因(multidrug resistance-related protein gene，MRP)。mdr1 基因位于人染色体 7q21~23，具有 28 个外显子，cDNA 全长 4.5kb，编码的 P-gp有 1280 个氨基酸，分子量 170 kD，故又称为 P-gp170。 P-gp170 属于ATP 依赖性转运蛋白超家族成员，为具有泵功能的跨膜蛋白，能利用ATP 能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，从而介导细胞产生耐药性。研究发现，经放射线照射后肿瘤细胞同样产生多药耐药(multidrugresistance, MDR)现象。P-gp170 不仅存在于肿瘤细胞，在肠道、肝脏、肾上腺等全身组织均有广泛分布，且具有重要的生理功能。 为抑制肿瘤 MDR，人们进行了大量尝试。理论上，可在 DNA、RAN和蛋白三个水平阻滞 P-gp170 蛋白的功能发挥。直接针对 P-gp170 的钙通道阻滞剂维拉帕米和免疫抑制剂环孢霉素 A 等是研究最多的具有逆转 MDR 作用的化学制剂。然而，其效果并不理想，也无法特异性地作用于肿瘤细胞。 反义技术可特异性封闭细胞内基因表达，包括运用质粒、病毒等载体转染细胞，持续性封闭或运用反义寡聚核苷酸瞬时封闭基因。针对肿瘤细胞的 MDR，多数研究人员运用反义寡核苷酸封闭培养细胞中mdr1 的表达。然而，反义寡核苷酸在细胞培养环境或血液、组织液中 5<WP=11>重庆医科大学博士学位论文极易被 DNA 酶降解，高浓度的寡核苷酸对细胞会产生毒性作用，因此限制了其实际应用价值。 本课题运用反义技术，将编码 mdr1 的 cDNA 序列从起始位点开始的 200bp 序列反向插入腺病毒载体，使肝癌细胞被腺病毒转染后，反义 mdr1 得以在细胞内转录，以封闭正义 mdr1 的转录和表达，从而降低 P-gp170 蛋白翻译，降低癌细胞对化疗药物的耐受。 基因治疗运用于临床最重要的瓶颈问题是基因载体的选择。目前基因载体大致可分为病毒载体和非病毒载体两大类。最具临床运用前景的是病毒载体，而重组腺病毒载体具有的独特优势，又使其成为最受关注的研究热点之一。 基因治疗运用于临床前还必须解决目的基因在体内表达的靶向性问题。以本实验为例，当 HCC 细胞中 mdr1 基因被封闭后，其对化疗药物的耐受性将下降，但如果反义基因同时在体内所有细胞中被均等转录，必然将导致全身细胞对化疗药物耐受的普遍降低，这对于造血细胞无疑是极其不利的。因此，治疗基因的靶向性表达仍然需要进行深入研究。 本实验针对 HCC 恶性肿瘤细胞的多药耐药问题，以体外培养的肝癌 HepG2 细胞为实验对象，采用阿霉素分级诱导，培养出 HepG2 MDR表型细胞株；基于腺病毒 Adeno-XTM expression system, 我们用从人基因组克隆的 271 bp 特异甲胎蛋白启动子替换病毒穿梭质粒 pshuttle 的CMV 启动子，将 mdr1 基因转录起始位点后 200 bp cDNA 片段反向插 6<WP=12>重庆医科大学博士学位论文入至 pshuttle 多克隆位点(Multiple cloning site, MCS)。构建成携带 mdr1反义cDNA的靶向腺病毒载体；进而重组腺病毒转染MDR 表型HepG2细胞，检测其对 MDR 的逆转作用。与此同时，我们还检测了该腺病毒载体携带基因表达的靶向性。主要实验结果与结论如下： 1. 采用 0.01~2.0 μg/ml 阿霉素分级诱导 AFP 阳性的 HepG2 细胞，以获得 MDR 表型的耐药 HepG2 细胞株 HepG2R。用免疫细胞化学、Western blot 检测 P-gp170 的表达；RT-PCR、Northern blot 检测 mdr1表达水平；MTT 法测定 HepG2 和 HepG2R 细胞在阿霉素、5-FU、紫杉醇(Taxol)等三?