【摘 要】
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本课题主要目的是研究23S rRNA甲基转移酶——硫链丝菌肽抗药性RNA甲基转移酶TSR和那西肽抗药性RNA甲基转移酶NHR的生化功能,探讨细菌对含硫多肽类抗生素产生耐药性的分子机
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本课题主要目的是研究23S rRNA甲基转移酶——硫链丝菌肽抗药性RNA甲基转移酶TSR和那西肽抗药性RNA甲基转移酶NHR的生化功能,探讨细菌对含硫多肽类抗生素产生耐药性的分子机制。本课题主要采用了以下方法进行研究1.构建克隆,体外表达并纯化TSR和NHR蛋白2.利用T7聚合酶体外转录系统,体外转录生成23S rRNA底物片段,包括58 bp和29 bp两种长度3.构建RNA甲基转移酶活性的体外检测体系,在存在[14C]-SAM的情况下,利用液体闪烁计数仪测定相应底物RNA被甲基化的程度4.通过Gel shift方法观察RNA底物与TSR或NHR蛋白的体外相互结合作用5.通过测量荧光偏振各向异性(Anisotropy)测定TSR、NHR蛋白与RNA底物的亲和力常数通过以上方法,得到以下结果：1.得到体外表达并纯化的TSR和NHR蛋白以及RNA底物2.TSR蛋白和NHR蛋白均能将RNA底物甲基化,且NHR甲基转移酶活性更强；此外比起29 bp RNA,58 bp RNA是更为适合的底物3.TSR和NHR蛋白与RNA底物均有结合,且结合强度均随蛋白浓度增加而增强4. TSR、NHR蛋白与两种长度的RNA底物的亲和力常数相近,均在微摩尔级别
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