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目的:研究烟曲霉菌感染的正常小鼠和IPA小鼠的肺组织胞核NF-κB和胞浆TNF-α的早期表达水平与抗烟曲霉菌的关系,以及对侵袭性肺曲霉病的发病影响。方法:1 IPA模型小鼠的建立将BALB/c清洁级小鼠160只随机分为四组,每组40只小鼠。A组正常组;B组免疫抑制组(注射环磷酰胺);C组正常+烟曲霉菌接种组(接种烟曲霉菌);D组IPA模型组(注射环磷酰胺并接种烟曲霉菌)。B、D组小鼠腹腔注射环磷酰胺,A、C组腹腔注射等量的生理盐水。C、D组小鼠鼻腔吸入烟曲霉菌感染小鼠。接种烟曲霉菌8h,24h,48,72h各时相点,取血液,处死小鼠,无菌取脾脏、胸腺和肺组织,采用血液白细胞计数、肺组织MPO值、胸腺指数、脾脏指数、菌落计数的测定和肺组织的病理学观察等指标,对IPA模型小鼠的建立进行评价。2 Western blot测定小鼠肺组织胞核NF–κB p65蛋白和胞浆TNF-α蛋白的表达取出接种烟曲霉菌8h~72h各时相点小鼠肺组织,分别提取肺组织胞核蛋白和总蛋白。样品蛋白经SDS-PAGE电泳,电泳分离的蛋白条带转膜。将转有蛋白的膜进行免疫反应,分别与相应一抗、二抗杂交以检测胞核蛋白NF–κB p65、胞浆TNF-α和作为内参的β-actin蛋白,ECL化学发光后对胶片进行曝光,将胶片上的蛋白条带进行扫描,用图象分析软件对目标带进行半定量。3小鼠肺组织MPO值测定取肺组织100mg加0.5%CTAB溶液2mL,用玻璃匀浆器制备匀浆,超声粉碎亚细胞成分(50瓦10秒,共5次)。于4°C以12000g离心20min。取0.1mL上清加反应液2.9mL。保持温度25°C,立即置分光光度计在460nm波长下进行2分钟时间扫描。以第30秒到第90秒的1分钟内吸光度的变化代表酶活力的改变。1单位MPO活力以25°C分解1mmolH2O2来表示。结果:1、IPA模型小鼠的建立IPA组小鼠吸入烟曲霉孢子后8h~72h,腹腔注射环磷酰胺的免疫抑制组小鼠中血液白细胞计数、肺组织MPO值、胸腺指数、脾脏指数均显著低于正常组小鼠(P <0.05)。IPA组小鼠肺组织病理切片观察发现,烟曲霉菌孢子萌芽成菌丝,菌丝侵入肺组织,导致肺泡严重坏死,表现为急性肺损伤。说明本研究中的IPA模型小鼠得以有效地建立,有助于进一步研究抗烟曲霉菌感染的天然免疫及IPA发病机制。2、Western blot测定各组小鼠肺组织细胞核中NF–κB p65蛋白和胞浆TNF-α蛋白的表达接种烟曲霉菌8h~72h各时相点,免疫抑制组小鼠肺组织胞核NF-κB和胞浆TNF-α表达均低于正常组小鼠(P<0.05)。接种烟曲霉菌8h~72h各时相点,正常+接种烟曲霉菌组和IPA模型组小鼠肺组织胞核NF-κB和胞浆TNF-α表达均显著高于正常组(P<0.05)。3、小鼠肺组织MPO值测定接种烟曲霉菌8h~72h,正常+接种烟曲霉菌组、IPA模型组小鼠肺组织MPO值显著高于正常对照组和免疫抑制组(P<0.05);免疫抑制组小鼠肺组织MPO值显著低于正常对照组(P<0.05),正常+接种烟曲霉菌组小鼠肺组织MPO值显著高于IPA模型组(P<0.05)。结论:1、本研究有效地建立免疫抑制小鼠,2、本研究成功建立IPA小鼠模型:肺组织病理观察结果显示,IPA小鼠出现典型早期急性肺组织损伤。3、烟曲霉菌孢子感染早期可以活化小鼠肺组织细胞中的NF-кB蛋白,上调肺组织细胞核中的NF-кBp65,促进小鼠肺组织细胞内TNF-α蛋白的表达。4、本研究揭示了小鼠腹腔注射环磷酰胺可以显著地降低肺组织胞核NF-кBp65和胞浆TNF-α生理性表达水平,是肺组织烟曲霉菌孢子感染演化为IPA的分子机制之一。