由于神经元凋亡而引起神经元丢失是神经退行性疾病如帕金森氏病(Parkinson’s Disease，PD)和老年性痴呆症(Alzheimer's Disease，AD)的主要病理特征。神经元凋亡的发生取决于抗神经元凋亡通路信号和促神经元凋亡通路信号之间的平衡。阐明神经元凋亡的信号转导和基因调控机制，对揭示神经退行性疾病发生的本质，寻找、确立药物靶点，从而达到有效防治神经退行性疾病的目的，具有重要的意义。 神经元凋亡是由一系列基因控制的主动过程，转录抑制剂actinomycin D及蛋白合成抑制剂cycloheximide可以有效地保护神经元，说明凋亡的发生需要新的RNA的转录以及蛋白质的合成。从关键的信号转导通路入手，系统地寻找凋亡过程中的关键分子，并探索其调控机制对于认识凋亡发生的本质，以及干预凋亡的发生具有重要意义。 体外培养的高纯度(>95％)小脑颗粒神经元(cerebellar granule neuron，CGN)是神经元凋亡及其信号转导机制研究最经典、最常用的细胞模型之一。体外原代培养的小脑颗粒神经元的存活有赖于"电活性"或神经营养因子的"营养"作用，如用高浓度KCl模拟体内"电活性"。当培养在高浓度KCl(25 mM KCL25 K)培养基的小脑颗粒神经元分化成熟时，将培养基中的高浓度KCl换成低浓度KCl(5 mM KCl)(撤钾处理)，小脑颗粒神经元即发生典型的凋亡，有50％的神经元在24小时内发生凋亡。利用这一凋亡模型，一些关键的调控细胞凋亡的信号转导通路得以发现和阐明，如PI3K/Akt、Akt/FKGRL1、cAMP/PKA/GSK-3 β和JNK/c-Jun通路。 谷氨酸是哺乳动物中枢含量最丰富的兴奋性神经递质，参与中枢神经系统的信息传递，维持着神经系统的正常功能。近年来的大量研究表明：持续性或短暂性、全脑或局部脑缺血，将导致兴奋性氨基酸谷氨酸量的明显增加，过量的谷氨酸激活突触后膜的兴奋性氨基酸受体，产生兴奋性毒性作用，促进NMDA通道的大量开放，随之而来的钙超载是脑缺血后神经元死亡的主要的胞内机制，进而诱发各种神经变性疾病。利用体外培养的神经元建立离体的谷氨酸神经毒性模型，以模拟在体脑缺血/脑中风等病变已广泛用于许多研究。在体外原代培养的神经元，谷氨酸的兴奋毒性造成神经元死亡的方式是凋亡还是坏死是有争议的，但是近年的研究证明，在谷氨酸诱导小脑颗粒神经元的死亡中凋亡和坏死共存。在给予谷氨酸刺激的数小时里，有一部分敏感的神经元很快出现细胞肿胀、破裂而发生坏死，但是在早期的兴奋性毒性刺激中存活下来的这一部分神经元，则会发生以核固缩、DNA降解等为特征的迟发性凋亡。因为凋亡的发生需要一定的时间，而且在适当的条件下可以逆转神经元凋亡的情况，有挽救的可能性，所以研究可以抑制凋亡的化合物有更重要的临床治疗意义。在这一凋亡模型，一些关键的调控细胞凋亡的激酶已经被发现和阐明，如PI3K/Akt、p38 MAPK等。 糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是一个多功能的丝氨酸/苏氨酸类激酶，在真核生物中普遍存在。GSK-3在刚发现的时候认为仅参与肌肉能量储存和新陈代谢。新近研究发现，GSK-3能磷酸化多种底物，包括代谢与信号蛋白、细胞结构蛋白和转录因子等，因而在细胞的生长、发育、肿瘤发生等过程中发挥着重要的作用。目前为止，发现了多种GSK-3作用底物，其中包括糖原合成酶、转录起始因子eIF2、热休克蛋白转录因子(HSF-1)、c-Jun、c-Myc、c-myb、CREB等。GSK-3功能失调有可能导致心境障碍(Mood disorders)、精神分裂症(Schizophrenia)、老年性痴呆症(Alzheimer disease，AD)、Ⅱ型糖尿病(Type Ⅱ diabetes)、癌症等疾病。GSK-3调节这些不同的通路的精确机制及其上下游关系还不清楚，是目前研究的一大热点。 研究目的： 1、比较GSK-3在两种凋亡模型中的活性变化。 2、比较GSK-3在两种凋亡模型中的作用。 实验方法及结果： 1、撤钾和谷氨酸处理诱导神经元凋亡 为验证本课题所使用两种模型诱导神经元死亡的方式是凋亡还是坏死，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，把培养条件换成无血清的含5 mmol/LKCl培养基或加入75gmol/L的glutamate时分别处理12、24小时后，进行Hoechst33258核染色，在相差显微镜和倒置荧光显微镜下观察神经元形态。可见25K和血清对照组神经元胞体饱满透亮，突起之间形成的网络清晰而完整，核内DNA分布相对均匀，呈现体积较大的浅染核形态；而撤钾和谷氨酸处理后神经细胞皱缩、体积变小、形态改变，细胞膜完整，神经元轴突和树突断裂、减少，核内DNA浓聚，核出现不同程度的固缩，故呈现体积明显缩小的深染核形态。 收集撤钾和谷氨酸处理后的神经元，提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，撤钾和谷氨酸处理神经元后可以观察到典型的阶梯状DNA区带图谱(DNA ladder),显示DNA有片段性断裂，神经元发生凋亡；25K和血清对照组的凝胶泳道上则看不到阶梯状DNA区带图谱，显示DNA完整无断裂。 2、GSK-3在撤钾诱导的CGNs凋亡时被激活 为检测GSK-3的活性，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，分别用25 K或5 K培养基处理1小时、2小时、4小时、6小时。收集蛋白后用磷酸化特异的GSK-3抗体检测GSK-3是否激活。观察到撤钾处理后GSK-3处于去磷酸化状态，即处于激活状态，同一张膜上检测到不同处理组GSK-3的总蛋白量保持一致，说明GSK-3磷酸化信号的变化不是蛋白上样量的差异造成的。 3、GSK-3在谷氨酸诱导的CGNs凋亡时不激活 为检测GSK-3的活性，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，用谷氨酸处理10分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时。收集蛋白后用磷酸化特异的GSK-3抗体检测GSK-3是否激活。观察到谷氨酸处理后GSK-3处于磷酸化状态，即处于失活状态，同一张膜上检测到不同处理组GSK-3的总蛋白量保持一致，说明磷酸化信号的变化不是蛋白上样量的差异造成的。为了验证谷氨酸模型的建立是成功的，我们选用在谷氨酸模型中被磷酸化处于激活状态的p38 MAPK作为阳性对照，检测其磷酸化水平，结果显示：p38在谷氨酸处理10min时磷酸化水平即升高，说明谷氨酸模型是成功的。 4、抑制GSK-3的活性可以保护性干预撤钾诱导的CGNs凋亡 为了研究GSK-3激活对撤钾诱导的神经元凋亡的必要性，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，使用GSK-3抑制剂AR-A014418、CT99021、SB415286处理后，Hoechst33258染色显示核形态，细胞核固缩或碎裂记为凋亡细胞，倒置荧光显微镜观察并拍照。结果显示，GSK-3抑制剂SB415286、AR-A104418和CT99021处理组，可以将5 K的凋亡率从58％降到18％、22％和21％。以上结果表明，抑制GSK-3活性，可以保护性干预撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。 5、抑制GSK-3的活性对谷氨酸诱导的CGNs凋亡没有保护作用 为了研究GSK-3激活对谷氨酸诱导的神经元凋亡的影响，我们将体外培养7天的小脑颗粒神经元，使用GSK-3抑制剂AR-A014418、CT99021、SB415286处理后，Hoechst33258染色显示核形态，细胞核固缩或碎裂记为凋亡细胞，倒置荧光显微镜观察并拍照。结果显示，在Glu时有51％的细胞出现凋亡时的核固缩形态，而GSK-3抑制剂AR-A014418，CT99021和SB415286处理组，在Glu时凋亡率分别为54％、47％和52％，与对照组相比没有统计学差异。以上结果表明，抑制GSK-3活性对谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡没有保护作用。 6、干扰质粒有效特异抑制GSK-3表达，并保护性干预撤钾诱导的CGNs凋亡 为证明GSK-3在神经元凋亡中的作用，我们通过RNA干扰技术抑制GSK-3的表达，观察GSK-3对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用。运用小分子干扰的设计软件及其原则，设计干扰序列，通过BLAST，目的干扰序列与其他基因没有显著的同源性，并将合成的具有发夹结构的寡核苷酸链克隆到BS/U6载体；将shGSK-3同β-gal用钙磷沉淀的方法共转染小脑颗粒神经元，免疫细胞化学方法检测对GSK-3表达的干扰有效性；将干扰质粒同GFP质粒用钙磷沉淀的方法共转染小脑颗粒神经元，Hoechst 33258进行核染色，统计干扰质粒对转染细胞凋亡的影响。结果显示：测序表明成功构建了shGSK-3质粒；shGSK-3能够有效干扰GSK-3的表达；干扰GSK-3可以保护性干预撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。以上结果表明：小分子干扰GSK-3可以保护小脑颗粒神经元，GSK-3在神经元凋亡时起重要作用。 结论： 1、GSK-3参与低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，抑制GSK-3活性保护性干预神经元凋亡； 2、GSK-3不参与谷氨酸诱导的小脑颗粒神经元凋亡，抑制GSK-3活性对凋亡无保护作用； 3、GSK-3两种亚型均可促神经元凋亡。