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安全、有效和稳定的抗原和佐剂是疫苗研究的重点和难点。本课题面向灭活口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)抗原易发生裂解导致免疫活性降低的问题,对影响灭活病毒颗粒结构稳定性和免疫活性的因素和规律进行了深入分析,提出利用过渡金属离子和离子液体(Ionicliquids,ILs)增强病毒衣壳蛋白五聚体界面相互作用、避免颗粒解聚提高其稳定性的新策略;并将抗原的稳定策略和佐剂设计相结合,设计和制备了基于离子液体的新型O/IL纳米乳液,提升了 FMDV疫苗的稳定性和免疫应答,并将研究结果拓展应用于流感裂解疫苗佐剂的设计。主要研究结果和创新点如下:(1)发现过渡金属离子Ni2+和Cu2+与146S(即结构完整的FMDV)能发生特异性结合,且结合规律不同于非过渡金属离子Ca2+。通过等温滴定量热、微量热泳动分析、以及ICP-MS分析,发现Ni2+、Cu2+和Ca2+三种离子均能与FMDV发生焓驱动的自发性结合,即ΔG＜0,ΔH＜0、ΔS＜0。其中Cu2+与146S结合亲和力最大;Ni2+和Cu2+在146S上的结合数量为Ca2+的10倍以上。(2)利用过渡金属离子的结合提高146S的稳定性和免疫活性,并对其机理进行分析。发现Ni2+、Cu2+、Ca2+与146S的结合均能提高抗原的热稳定性,其中Cu2+稳定效果最显著;此外,Ni2+和Cu2+的结合还能提高146S的耐酸稳定性,而Ca2+的结合则不利于颗粒的耐酸稳定性。提出了过渡金属离子与146S五聚体界面相邻组氨酸间通过配位作用形成“过渡金属离子桥”而稳定146S结构的机理。采用结合了 Ni2+或Cu2+的146S对小鼠进行免疫,发现比单一的146S能产生更高的抗体滴度。通过146S与细胞表面受体整合素β6和硫酸乙酰肝素的亲和力实验,表明Cu2+的结合使抗原与两种受体的亲和力分别提高了 3倍和10倍。(3)采用胆碱型离子液体调节146S微环境的质子强度,提高抗原的稳定性。发现胆碱型离子液体[Cho][Cl]和[Cho][SO4]可将146S的颗粒热变性温度Tm1值提高4℃;而[Cho][H2PO4]则降低了 146S的热稳定性。通过分析不同离子液体对146S颗粒微环境pH值的影响,提出了[Cho][Cl]和[Cho][SO4]通过降低146S周围微环境的质子强度,而抑制146S颗粒五聚体交界处组氨酸的质子化从而稳定146S的机理。小鼠免疫实验表明添加[Cho][Cl]和[Cho][SO4]对146S的体内免疫活性无显著影响。(4)构建了基于离子液体的O/IL纳米乳液,并用于FMDV疫苗注射免疫佐剂,提高了机体的体液免疫应答。将胆碱型离子液体的阴离子替换为具有生物学活性的烟酸,构建了离子液体[Cho][nicotinic](CANI),并以该离子液体替代水相、以角鲨烯为油相、Tween80为表面活性剂制备出粒径约为160nm的均一、稳定的O/IL纳米乳液。与市售乳液佐剂ISA-206相比,O/IL乳液能显著提高146S的稳定性,用于FMDV疫苗注射免疫佐剂能显著增强机体的体液免疫应答,产生与使用ISA-206佐剂相当的IgG滴度。(5)将O/IL纳米乳液用于H1N1型流感裂解疫苗的注射和鼻黏膜免疫佐剂,均展现出很好的佐剂效应。将O/IL纳米乳液用于H1N1的注射免疫佐剂,产生的IgG滴度显著高于MF59佐剂;用于H1N1的鼻黏膜免疫佐剂,在增强的黏膜免疫应答的同时,还能提高体液和细胞免疫应答,产生的sIgA、IgG滴度和IFN-γ水平均显著高于使用MF59佐剂。O/IL乳液提高鼻黏膜免疫应答效果的作用机制包括:延长HA在鼻腔的停留时间,促进鼻黏膜相关淋巴组织中DC细胞和CD4+T细胞的增殖。