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第一部分大鼠原代视网膜神经节细胞的培养和鉴定及高糖模型的建立目的:分离、培养、鉴定大鼠原代视网膜神经节细胞,建立体外大鼠视网膜神经节细胞原代培养的高糖模型,并观察评估所建模型的有效性。方法:木瓜蛋白酶消化法提取出生1-3天SD大鼠视网膜神经细胞进行原代培养,采用免疫荧光特异性标记Brn3a进行视网膜神经节细胞鉴定。连续原代培养24h时,加入五氟尿嘧啶(5-Fu)和尿苷(uridine)混合溶液(5-Fu+uridine)进行纯化培养。连续原代培养48h时,换液并随机建立高糖模型组和对照组。对照组:糖浓度为Ommol/L。葡萄糖干预组:糖浓度10mmol/L,20mmol/L,30 mmol/L。分别在换液后连续培养Oh、24h、48h时观察贴壁细胞状态。倒置电子显微镜下观察估算细胞存活率。结果:接种后立即观察,显微镜下见大部分细胞贴壁,偶可见突触,形态明显。原代培养24h显微镜下可见绝大部分细胞贴壁生长,小片状融合聚集生长。原代培养48h,即加入5-Fu+ uridine混合溶液处理后24h,贴壁细胞数目减少,其轴突形态清晰,大面积融合聚集生长。免疫荧光结果显示贴壁细胞呈bm3a染色和DAPI染色双阳性。鉴定结果证实本实验所培养的细胞为大鼠视网膜神经节细胞。高糖处理后在Oh、24h、48h时显微镜下观察贴壁细胞状态,与对照组OmM相比,各高糖组均出现不同程度的贴壁细胞凋亡。结论:本实验建立的原代视网膜神经节细胞培养方法可获得较为纯化的原代大鼠视网膜神经节细胞,通过添加葡萄糖可以有效建立高糖模型,可用于后续实验研究。第二部分TLR4/NF-κB信号通路在高糖环境下原代培养的大鼠视网膜神经节细胞损伤中的表达及作用的研究目的:研究高糖对原代培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)中TLR4/NF-κB信号通路表达的影响,为临床糖尿病视网膜病变的治疗提供有效的治疗靶点。方法:木瓜蛋白酶消化法提取出生1-3天SD大鼠视网膜神经节细胞进行原代培养,随机分为对照组(糖浓度OmM)、高糖组(糖浓度10mM,20mM,30mJM)、高糖抑制剂组(糖浓度20mM+TAK-242)、高糖抑制剂对照组(糖浓度20mM+DMSO)连续培养24h和48 h后分别选用实时荧光定量法(RT-PCR)法、蛋白质免疫印迹法(Westernblot)和酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定RGC中TLR4,NF-κB,MyD88,TRAF6,NLRP3,IL-1 β,IL-18 的 mRNA 及蛋白表达情况。使用荧光双染色(Annexin V-FITC/PI)进行各组细胞凋亡率检测。结果:与对照组相比,高糖组原代培养的RGCs中TLR4,NF-κB,MyD88,TRAF6,NLRP3,IL-1 β,IL-18的mRNA及蛋白表达量升高,高糖组原代培养的RGCs凋亡率升高,差异有统计学意义(均p<0.05)。与高糖组相比,高糖抑制剂组原代培养的 RGCs 中 TLR4,NF-κB,MyD88,TRAF6,NLRP3,IL-1 β,IL-18的mRNA及蛋白表达量下降,高糖抑制剂组原代培养的RGCs凋亡率降低,差异有统计学意义(均p<0.05)。结论:高糖环境下原代培养的视网膜神经节细胞中TLR4/NF-κB信号通路表达激活。抑制TLR4/NF-κB信号通路表达可减轻高糖诱导的原代培养的视网膜神经节细胞的炎症和凋亡,这为临床糖尿病视网膜神经病变的治疗提供了新思路和靶点。