蛋白质作为生命物质基础,是整个生命活动的重要参与者。循环肿瘤细胞作为癌细胞转移的启动子,是癌症转移的重要指示。这两者均是重要的疾病标志物,其在人体内的含量与各种疾病息息相关,因此开展蛋白质和循环肿瘤细胞相关的研究可以为疾病诊断、临床治疗及预后评估提供可靠的依据。然而,实际生物样品极其复杂,且疾病标志物的含量一般较低,因此使得疾病标志物的相关研究变得异常的艰难。电化学生物传感器是对生物物质敏感且能将其浓度转换为电信号进行检测的一种装置,具有灵敏度高、选择性好、仪器便携、响应快速、成本低廉等优点。但是传统的电化学生物传感器仍然无法满足低含量疾病标志物高灵敏、高选择性检测的需求。为此,在本论文中,我们采用亲和性好、特异性高的适配体和抗体作为生物识别元件,结合双识别和多价结合策略增强选择性,借助酶、纳米材料、链置换反应及DNA自组装技术进行信号放大,提高检测灵敏度,从而构建高灵敏、高选择性的电化学生物传感器实现对低含量疾病标志物（凝血酶和循环肿瘤细胞）的定量分析。实验结果显示,本论文构建的电化学生物传感器对凝血酶和循环肿瘤细胞的检测具有较高的灵敏度和选择性,并能应用于稀释血清或全血样本中凝血酶和循环肿瘤细胞的检测,表明构建的传感器具有潜在的临床应用价值。本论文具体的研究工作主要分为以下几个部分:1.目标物引发的自发邻位触及适体传感器用于凝血酶的放大电化学检测开发灵敏简便的方法用于痕量疾病标志物（蛋白质）的检测对疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。为此在本研究工作中,我们将凝血酶作为目标模型分子,利用目标物引发级联链置换反应实现信号放大,构建了一个灵敏、简单的电化学生物传感器用于疾病标志物蛋白质的定量分析。目标凝血酶与部分互补双链DNA中的适配体链结合,释放出一条单链DNA作为引发链,这个引发链触发级联的DNA链置换反应,从而催化标记有亚甲基蓝（MB）的DNA链自组装得到大量的两端均标记有MB的DNA双链作为亲和探针。由于邻位触及效应,这些两端均标记有MB的DNA双链探针能与电极表面的捕获探针杂交形成稳定的结构,从而使MB靠近电极表面,产生放大的电化学信号,实现对凝血酶的灵敏检测,检测限低至23.6 pmol L^-1。此外,该适体传感器能将凝血酶与其他干扰蛋白质区别开来,具有较高的选择性,并能对稀释血清中的凝血酶进行检测,表明该传感器能用于复杂样品中痕量疾病标志物蛋白质的检测,因此在疾病的早期诊断中具有潜在的应用价值。2.适配体/蛋白质邻位触及引发的分子机器用于凝血酶的高灵敏电化学检测在不采用任何酶及复杂纳米材料的条件下,发展简单、灵敏且高选择性的方法用于蛋白质的检测对疾病的诊断具有重要的意义。在这个工作中,我们采用一个新型的适配体/蛋白质邻位触及引发的分子机器作为信号放大策略来构建高灵敏电化学生物传感器以实现对血清中凝血酶的高选择性检测。将三条DNA单链杂交形成的双链结构通过自组装固定到金电极表面。两条含有不同凝血酶适配体序列的亲和探针同时与凝血酶结合引发邻位触及诱导的链置换反应,将电极上双链结构中较短的一条DNA链置换出来,并暴露出一段toehold区域。此时标记有亚甲基蓝的DNA单链（MB-DNA）作为燃料链与toehold区域杂交,并引发第二个链置换反应,将适配体/蛋白质复合物的一端置换下来,使其在电极表面不断地行走,引发更多的链置换反应,从而启动分子机器的循环运作,达到信号放大的目的。最终,大量的MB-DNA被捕获到电极表面,产生放大的电流响应,实现对凝血酶的灵敏检测,检测限低至1.7 pmol L^-1。传感器实现信号放大的过程不需要酶的参与,并且能用于血清样品中凝血酶的高特异性检测。此外,可以通过简单地改变亲和配体,将该传感器用于其他蛋白质的分析检测中,因此该传感器有望成为一个通用的蛋白质检测平台。3.邻位触及和金属离子DNAzyme循环放大相结合构建的免标记电化学适体传感器用于凝血酶的灵敏检测凝血酶在神经退行性疾病和心血管等疾病的诊断中起着重要的作用,对凝血酶进行检测有助于相关疾病的早期诊断。因此在这个工作中,我们结合邻位触及诱导的链置换反应和金属离子DNAzyme循环剪切信号放大技术,提出了一种简单且灵敏的策略用于人血清中凝血酶的检测。两个含有不同凝血酶适配体的亲和探针同时与凝血酶结合导致两条亲和探针的局部浓度增加,产生邻位触及效应,从而诱导链置换反应的发生,释放出酶链。释放出来的酶链与电极表面含G-四分体形成序列的底物发夹探针杂交形成完整的金属离子DNAzyme。在金属离子作用下,酶链不断地循环切割底物链并释放出大量的G-四分体形成序列。在K⁺存在下,氯化血红素（hemin）与这些释放出来的序列结合,在电极表面形成G-四链体/hemin复合物。在电位扫描过程中,hemin与电极之间的直接电子转移可以产生一个显著放大的电流信号,从而实现对凝血酶的免标记检测,检测限可达皮摩尔的水平。此外,适配体的高亲和性和双识别策略的高选择性,使该传感器能特异性识别复杂血清中的凝血酶,为蛋白质的高灵敏、高选择性检测提供了新的思路。4.通过双识别策略实现对全血中循环肿瘤细胞的高灵敏、高特异性的即时检测循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）的鉴定和检测在癌症的监测和诊断中起着至关重要的作用,但是CTCs在外周血中的数目极其稀少,因此分离和检测这些细胞仍然面临着一个巨大的挑战。本文将双识别策略和商业化的血糖仪相结合,构建了一种高灵敏、高选择性的方法用于全血中稀有循环肿瘤细胞的即时检测。将修饰有抗体的磁珠用于CTCs的捕获和分离,而修饰有蔗糖酶和另一种抗体的聚苯乙烯微球则用于产生可检测的信号。由于采用了双识别模式,这个方法具有较高的选择性,并且通过聚苯乙烯微球负载大量的蔗糖酶进行信号放大,实现了低至7个细胞的检测限。更重要的是,该方法采用一个简单的血糖仪实现了对全血中CTCs的即时检测,为各种癌症的诊断提供了一种简单便捷且具有吸引力的可以替代传统活检的方法。5.原位产生的多价适配体网络用于全血中循环肿瘤细胞的高效捕获和灵敏电化学检测循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）的相关研究可为癌症的转移诊断、预后和治疗提供重要的信息。然而,循环肿瘤细胞的数目十分稀少,且其存在于一个极其复杂的血液环境中,因此对循环肿瘤细胞进行监测面临着巨大的挑战。在本文中,我们提出了一种在电极表面原位产生多价适配体网络的方法,用于全血中CTCs的高效捕获和灵敏电化学检测。通过滚环扩增放大技术使电极表面修饰的引物/环状DNA模板复合物延伸,得到含有多个重复适配体片段的长链ssDNA,长链ssDNA可以通过多价合作结合的模式实现对稀有CTCs的高效捕获。随后,抗体和辣根过氧化物酶功能化的金纳米颗粒进一步与电极表面捕获的CTCs特异性结合,产生放大的电催化电流,实现对CTCs的高灵敏检测,检测限低至5个细胞。此外,该多价适配体网络修饰的传感界面可以成功地将靶标细胞与其他控制组的细胞区别开来,并能实现对全血中CTCs的检测,表明该方法在CTCs的实际临床监测方面具有潜在的应用价值。