研究背景心血管疾病是危害人类健康的主要杀手和公共健康卫生的巨大负担。2015年中国心血管病报告表明心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上,为我国居民的首位死亡原因。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病的共同发病基础,而高胆固醇血症是导致动脉粥样硬化的重要原因和风险因素。目前对动脉粥样硬化的治疗主要是以他汀类等降脂药为主,他汀类药物通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的合成,从而阻断胆固醇酯的合成,最终实现降低血脂防止AS的作用。但研究表明他汀类药物只对20%-40%的动脉粥样硬化患者起作用,并且可损伤肝脏以及导致横纹肌溶解,因此,寻找新的和有效的防治动脉粥样硬化的药物是非常重要和紧迫的。已经证实,过多的胆固醇在巨噬细胞中聚积形成泡沫细胞是AS发生的重要事件之一,而促进胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)可增加胆固醇的代谢分解,降低血浆中胆固醇水平,从而保持体内胆固醇平衡。ATP结合盒转运子A1(ATP binding cassette subfamily A member 1, ABCA1)是一种跨膜蛋白,在RCT中起着极其重要的作用。ABCA1主要介导细胞内游离胆固醇和磷脂流出至细胞外,与载脂蛋白A1 (apolipoprotein A1, ApoA 1)结合生成高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL),从而转运至肝脏进行分解代谢。因此ABCA1功能受损将会导致巨噬细胞内胆固醇的外流受阻,促使巨噬细胞成为泡沫细胞,进而浸润血管壁形成脂质斑块,促进AS的发生发展。研究表明,ABCA1基因突变可导致丹吉尔病(Tangier disease, TD)和家族性HDL缺乏症(family HDL deficiency, FHD),表现为血浆中高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平降低以及胆固醇在组织细胞中聚积,从而早发冠心病。并且在一般人群中,ABCA1基因的几个常见单核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism, SNP)也与血脂水平以及动脉粥样硬化的严重程度密切相关。因此,促进ABCA1蛋白的表达在降低血脂水平以及防治动脉粥样硬化发生发展中起着非常重要的作用。肝X受体a (Liver X Receptor, LXRa)是配体激活的核受体转录因子超家族成员之一,主要在脂质代谢活跃的组织中表达。LXRa能够使低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)泛素化,导致LDLR降解,抑制细胞摄取富含低密度脂蛋白的胆固醇,从而维持胆固醇的平衡。并且XRa基因敲除小鼠高脂喂养后,由于失去处理胆固醇的能力,不能将过多的胆固醇进行代谢,从而导致肝脏脂质堆积明显升高。这些体内外实验表明LXRa在维持胆固醇的平衡中具有重要的调控作用,表现出一定的抗动脉粥样硬化的作用。此外,众多研究表明,ABCA1基因是LXRa主要调控的靶基因之一。LXRa激动剂可诱导ABCA1的表达,增加胆固醇向质膜的转运,从而促进ApoA1介导的胆固醇流出。因此LXRα--ABCA1通路很可能是调控胆固醇代谢以及抗动脉粥样硬化药物作用的一个重要靶点。脂氧素A4(Lipoxin A4, LXA4)是一类花生四烯酸代谢产物,经脂氧化酶作用产生。因其能抑制炎症相关基因的表达,以及控制炎症反应的快速消退,被认为是炎症过程的“刹车信号”或“终止信号”。随着对LXA4的深入研究,发现其除可作为炎症调控的内源性物质之一外,在心血管疾病方面具有其他的生物学效应。在人脐静脉内皮细胞中,LXA4阻断脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)对TNF-α表达的促进作用,并通过抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)途径降低内皮细胞的渗透性,从而保护内皮细胞。阿司匹林诱生型LXA4能够调控血管平滑肌细胞的表型转换,阻断血小板源性生长因子(plateletderived growth factor, PDGF)导致的血管平滑肌细胞的迁移和增殖。另有研究表明,阿司匹林可上调小鼠肝脏中脂氧素的浓度,并调节血浆中胆固醇代谢。这些研究提示LXA4可能与AS等心血管疾病发生发展密切相关。然而,尽管LXA4与胆固醇水平有关,但其对胆固醇的调控作用尚不清楚,其调控胆固醇的作用机制尚不清楚。本实验采用与胆固醇代谢密切相关的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞进行研究,旨在观察LXA4对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。本研究发现在THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中,无论在基因水平还是蛋白水平,LXA4能浓度依赖性上调ABCA1的表达并促进细胞内胆固醇的流出,从而抑制泡沫细胞的形成,并且这一过程依赖于LXRα途径。本次研究的结果为LXA4可能成为调控胆固醇代谢的药物提供新的理论依据。研究方法1、细胞培养(1)THP-1细胞静置培养：RPMI-1640培养基加入10%新生胎牛血清混匀,同时在培养液中加100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素,放置37℃、5%CO2和湿度为100%的细胞培养箱中孵育。待细胞生长状态良好时,取对数生长期细胞进行实验。(2)诱导分化：加入100ng/ml浓度的佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)刺激THP-1细胞,诱导成为巨噬细胞：再加入浓度为50μg/ml的Ox-LDL诱导其成为泡沫细胞。(3)细胞转染：将细胞接种于6孔板中,待细胞融合度为80-90%时,按照lipofectamine RNAiMAX转染步骤将siRNA转染到泡沫细胞,转染48h后进行后续实验。2、氧化型低密度脂蛋白(oxidize low density lipoprotein, Ox-LDL)的准备将200μg/ml低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)溶液加入含硫酸铜的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer, PBS)中进行氧化,37℃条件下孵育24小时。加入含200mM乙二胺四乙酸(ethylene dinitrilotetraacetic acid, EDTA)的PBS溶液终止其氧化反应。然后在37℃下用PBS透析48小时以去除Cu2+,再用0.22μm孔径的滤器过滤除菌,最后用BCA试剂定量蛋白浓度,并将浓度调至1g/L,4℃保存备用。其中,新制备的Ox-LDL保存在含50 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl and 2.0 mM EDTA的混合液中,其保存的pH为7.4,并在使用前十天之内准备。3、RNA提取和实时荧光定量PCR按照TRIzol试剂盒提取THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的总RNA,用紫外分光光度计(Thermo, NanoDrop2000)进行RNA浓度的检测。将1μg总RNA用TAKARA逆转录试剂盒在普通PCR仪中反转录成20μl cDNA。在ABI 7500 FAST上进行实时定量PCR来扩增模板量,参照溶解曲线来分析PCR反应的特异性,以GAPDH表达量为内参并以AΔCt方法定量mRNA的相对表达量。4、免疫印迹(Western blot analyses)采用凯基蛋白提取试剂盒提取蛋白,采用BCA试剂检测蛋白浓度；对蛋白提取物定量后向剩余的蛋白提取物中加入其五分之一体积的5×SDS,混匀并煮沸10分钟,冷却后置-20℃待用。8%琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白ABCA1以及10%琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白LXRa,然后按说明书要求依次电泳、转膜、封闭以兔多克隆抗ABCA1、LXRa和β-actin一抗孵育过夜,洗涤孵育二抗再洗涤后,以化学发光法显示条带,检测目的蛋白的相对表达量。5、转染小分子RNATHP-1巨噬细胞源性泡沫细胞接种在6孔板中(2×106／孔),待细胞密度达到80%至90%时,用lipofectamine RNAiMAX转染LXRa-siRNA和空载siRNA。孵育37℃,48h后,用Trizol提取总RNA用于mRNA检测,用凯基蛋白提取试剂盒提取蛋白用于免疫印迹的检测。6、高效液相色谱分析待细胞处理结束后,用加样枪吸去旧培养基,用PBS清洗细胞3遍,然后加入200μ1的细胞裂解液,反复冻融3次,保证细胞裂解充分。采用BCA法检测蛋白浓度,然后加入浓度为7.2%的三氯乙酸来沉淀蛋白,放置片刻后在普通离心机以800×g的转速离心10min,吸取上清至新的EP管进行胆固醇检测,以豆甾醇为内标。其中取100μ1上清液来进行总胆固醇的检测,在这100μ1上清液加入200μl浓度为8.9mol/L的氢氧化钾溶液来水解胆固醇酯,水解胆固醇酯后的样品即为细胞内总胆固醇检测样品。各样品分别与内标液混匀,加入正已烷和无水乙醇进行抽提,再用浓度为1.5mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥,最后加入100μ1乙晴-异丙醇(80：20)溶解样品,上样于高效液相色谱仪。采用C-18柱,柱温4℃,流速1mL/min,250nm紫外光检测,胆固醇以峰面积定量,内标校准。7、胆固醇流出实验待用LXA4或siRNA-LXRa处理细胞结束后,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中加入0.2uCi/mL[3H]标记的胆固醇并共同孵育细胞,待细胞长至85%时,弃培养液,用PBS洗涤细胞,再用含载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,apoA1)而不含胎牛血清RPMI-1640的培养液孵育细胞。24h后,收集细胞培养液；并经PBS洗涤细胞后用闪烁液裂解细胞,用闪烁计数法分别检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇,单位为CPM。胆固醇流出率用培养液中CPM除以总CPM(培养液CPM+细胞CPM),再乘以100%来表示。8、统计分析采用SPSS 13.0软件进行数据分析,结果表示为：均数±标准差(x±s)。两组间各基因mRNA相对表达量、各蛋白免疫印迹条带相对灰度值的比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。每组实验重复3次,统计结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、LXA4上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1的表达。动脉粥样硬化的发生发展是巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞相互作用导致的结果。已有研究表明LXA4能够影响内皮细胞炎症反应和平滑肌细胞的增殖迁移,提示LXA4与动脉粥样硬化的发生密切相关。巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的主要病理过程之一,并且ABCA1是一个膜整合蛋白,在胆固醇代谢中起着重要的作用,因此我们首先探讨LXA4是否影响THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1的表达。我们采用OnM, 1nM, 10nM和100nnM等不同浓度梯度的LXA4刺激THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,分别采用荧光定量PCR和免疫印迹检测各组细胞中ABCA1的表达。结果显示LXA4在转录水平和转录后水平可浓度依赖性上调ABCA1的表达。2、LXA4上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中LXRa的表达。LXRa是配体激活的核受体转录因子超家族成员之一,是个胆固醇代谢相关的重要分子,在维持胆固醇的平衡中具有重要的调控作用。为了进一步观察LXA4对胆固醇代谢的影响,我们接下来探讨LXA4是否影响细胞中LXRa的表达。我们采用不同浓度OnM, 1nM,10nM和100nM的LXA4刺激THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹检测各组细胞中LXRa的表达。结果显示,无论在基因水平,还是在蛋白水平,LXA4可浓度依赖性上调LXRa的表达。3、LXRa途径介导了LXA4对ABCAl的上调作用。上述结果表明LXA4能同时上调ABCA1和LXRa的表达,并且众多研究表明ABCA1是LXRa调控的主要靶基因之一,因此我们推测在THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中LXA4可能通过LXRa途径上调ABCA1的表达。我们采用小分子RNA干扰技术敲减LXRa基因,结果显示LXRa表达量减少了88%。LXRa siRNA处理细胞后,LXA4对ABCA1的上调作用被抑制,表明LXA4通过LXRa途径上调ABCA1的表达。4、LXA4通过LXRa途径促进细胞内胆固醇流出和降低胆固醇含量。ABCA1是一种整合膜蛋白,主要参与胆固醇的逆向转运,它能够作为通道促进细胞内胆固醇流出并与细胞外的ApoA1结合,从而将过量的胆固醇运输至肝脏进行代谢。上述结果表明LXA4可以上调ABCA1的表达,因此我们接着观察LXA4对细胞中胆固醇流出的影响。与对照组相比,LXA4能够促进细胞内胆固醇流出：而干扰LXRa表达后,与对照组相比,LXA4处理对细胞内胆固醇流出影响差异没有统计学意义。同样的,与对照组相比,LXA4能降低细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量；而干扰LXRa表达后,与对照组相比较,LXA4处理对细胞内胆固醇含量影响差异没有统计学意义。结果表明LXA4通过LXRa途径促进细胞内胆固醇流出和降低细胞内胆固醇含量。结论1、LXA4浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1表达。2、LXA4浓度依赖性上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中LXRa表达。3、LXA4通过LXRa途径上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1的表达。4、LXA4通过LXRa途径促进细胞内胆固醇流出和降低细胞内胆固醇含量。