论文部分内容阅读
本论文包括两个部分：(一)siRNA对鼻咽癌细胞CNE1中S100A8、S100A9基因表达的影响及有效片段的筛选；(二)S100A8 siRNA与S100A9siRNA对鼻咽癌细胞CNE1迁移功能的影响。第一部分：siRNA对鼻咽癌细胞CNEl中S100A8、S100A9基因表达的影响及有效片段的筛选目的：通过将S100A8 siRNA、S100A9 siR NA分别转染鼻咽癌细胞CNE1后,观察S100A8、S100A9基因的表达水平变化以分别筛选有效片段。方法：1.分别合成三对S100A8 siRNA、S100A9 siRNA,分别标记为：S100A8-Homo-286, S100A8-Homo-324, S100A8-Homo-374； S100A9-Homo-61, S100A9-Homo-100, S100A9-Homo-267,利用脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染鼻咽癌细胞CNE1。采用标记有荧光的阴性对照FAM-siRNA在荧光显微镜下检测转染效率；2.转染24 h后,通过荧光定量PCR分别检测S100A8、S100A9的相对表达水平,分别筛选出干扰效果最好的siRNA片段。结果：1.应用阳离子脂质体Lipofectamine 2000瞬时转染法,Lipofectamine2000与siRNA按1：3进行转染时,转染效率最高。2.用荧光定量PCR法分别检测S100A8、S100A9的相对表达水平。结果显示：CNE1细胞中S100A8基因相对表达水平在S100A8-Homo-286, S100A8-Homo-324, S100A8-Homo-374组中与阴性对照组中比较,差异显著(P<0.05)；S100A9基因相对表达水平在S100A9-Homo-61, S100A9-Homo-100, S100A9-Homo-267组中与阴性对照组中比较,差异显著(P<0.05)。各三对片段中,S100A8-Homo-374 siRNA 与 S100A9-Homo-267siRNA干扰效果最好,抑制率分别为84.10%和74.15%。S100A8-Homo-374 siRNA组的S100A8基因相对表达水平与各对照组包括空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组相比,差异显著(P<0.01),空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组之间比较均无显著性差异(P>0.05)；相同地,S100A9-Homo-267 siRNA组的S100A9基因相对表达水平与各对照组包括空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组相比,差异显著(P<0.01),空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组之间比较均无显著性差异(P>0.05);因此选择抑制率最高的S100A8-Horno-374 siRNA 与S100A9-Homo-267 siRNA开展后面的实验。结论：脂质体介导的S100A8 siRNA、S100A9 siRNA分别转染鼻咽癌细胞CNE1,可特异性、高效地分别下调S100A8、S100A9基因的表达。不同的siRNA片段对基因表达的抑制效果不同,说明siRNA技术是一种抑制鼻咽癌细胞S100A8、S100A9基因表达的有效的方法。第二部分：S100A8 siRNA 与 S100A9 siRNA对鼻咽癌细胞CNE1迁移功能的影响目的：通过siRNA沉默S100A8、S100A9基因的表达,探讨S100A8和S100A9基因对鼻咽癌细胞CNE1迁移功能的作用。方法：1.采用第一部分筛选出的S100A8-Homo-374 siRNA与S100A9-Homo-267 siRNA以及阴性对照片段分别转染鼻咽癌细胞CNE1,同时设立空白对照组和脂质体对照组,通过划痕实验检测下调S100A8与S100A9基因的表达后细胞迁移率的变化,以检测对细胞迁移功能的影响。2.随后通过荧光定量PCR检测与肿瘤细胞侵袭和迁移密切相关的基质金属蛋白酶家族中MMP7基因的表达情况。结果：1.划痕实验显示：在各时间段(划痕后24 h,48 h,72 h)中,S100A8-Homo-374 siRNA 与 S100A9-Homo-267 siRNA组的细胞迁移率,均显著低于各对照组包括空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组(P值分别为P=0.001,P=0.004,P=0.001),而空白对照组、阴性对照组及脂质体对照组之间均无显著性差异(P>0.05)；2.用荧光定量PCR法检测MMP7的相对表达水平。结果显示：S100A8-Homo-374 siRNA 与 S100A9-Homo-267 siRNA 的MMP7基因的相对表达水平均低于各对照组包括空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组(P<0.01),空白对照组、阴性对照组、脂质体对照组之间比较均无显著性差异(P>0.05)。结论：S100A8-Homo-374 siRNA 与 S100A9-Homo-267 siRNA分别有效抑制了S100A8与S100A9的基因表达,细胞迁移功能有所减弱,对MMP7基因的表达有不同程度的抑制。