罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类之一。然而近年来由于链球菌病等病害的暴发,我国罗非鱼养殖产业承受了巨大的经济损失,因此探讨罗非鱼的抗病免疫机制具有重要意义。DEx D/H盒蛋白家族成员被发现可作为胞质传感器参与识别病毒核酸并激活下游信号通路,而三结构域（Tripartite motif,TRIM）蛋白家族是重要的调节因子,可作为E3泛素连接酶参与多种信号通路的调控。为了探究尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的分子免疫机制并探索病害防治的新办法,我们对尼罗罗非鱼TRIM35（OnTRIM35）、TRIM39（OnTRIM35）以及DEx D/H盒蛋白家族成员DDX43（OnDDX43）进行了克隆、表达特征及功能分析,为尼罗罗非鱼抗病机制的研究提供了资料。主要研究结果如下:1.OnTRIM35和OnTRIM39基因的克隆及表达分析尼罗罗非鱼TRIM35 cDNA序列全长3646 bp,其中开放阅读框（ORF）序列长1512 bp,可编码503个氨基酸。TRIM39 cDNA序列全长5025 bp,ORF序列长1650 bp,编码549个氨基酸。OnTRIM35和OnTRIM39在结构上具有高度保守性,都具有一个典型的RING结构域、一个B-Box锌指结构域、一个卷曲螺旋结构域以及C-末端结构域（PRY-SPRY）。同源性分析显示,OnTRIM35与斑马宫丽鱼（Maylandia zebra）TRIM35相似性最高,为96%;OnTRIM39和美妊丽鱼（Astatotilapia calliptera）TRIM39相似性最高,为83.5%。组织表达结果表明OnTRIM35在心脏和脾脏中具有较高表达;OnTRIM39在脾脏和肾脏中表达量较高。人工感染无乳链球菌和LPS、Poly I:C刺激可显著诱导OnTRIM35和OnTRIM39的表达。以上结果表明,OnTRIM35和OnTRIM39在尼罗罗非鱼抗病原体免疫机制中发挥重要作用。2.OnTRIM35和OnTRIM39的初步功能分析为初步研究OnTRIM35和OnTRIM39的功能及其在信号转导通路中的作用,本研究对上述基因进行了双荧光素酶报告分析、亚细胞定位、Pull-down联合质谱分析以及Pull-down蛋白互作实验。双荧光素酶活性分析结果显示过表达OnTRIM35和OnTRIM39可显著激活NF-κB的活性;共转染OnTRIM35和OnTRAF3可显著增强OnTRAF3介导的NF-κB的活性。亚细胞定位发现OnTRIM35和OnTRIM39在293T细胞中均定位于细胞质。Pull-down联合质谱分析实验得到250个OnTRIM39的目标结合蛋白,Pull-down蛋白互作实验结果表明OnTRIM35和OnTRAF3之间存在相互作用,而OnTRIM39和I3K4I3、I3KL45之间存在相互作用。3.OnDDX43的克隆及表达分析OnDDX43基因的cDNA序列长2338 bp,其中ORF长2064 bp,共编码687个氨基酸。SMART软件分析显示OnDDX43具有一个RNA结合域KH,一个典型的ATP水解结构域DEXD以及C末端结构域HELICc。OnDDX43与斑马宫丽鱼同源相似性最高,达98%。OnDDX43在健康鱼所有被检测组织/器官中普遍表达,其中在肌肉中具有最高的表达水平,在脑和脾脏中的表达量也相对较高。体内感染无乳链球菌以及LPS、Poly I:C刺激后均能诱导OnDDX43的表达。4.OnDDX43的初步功能分析在293T细胞中过表达OnDDX43可以显著增强IFN-β的活性,而对NF-κB和AP-1的活性无显著影响。亚细胞定位结果显示OnDDX43在细胞核和胞质中均有分布。GST-Pull-down结果显示,OnDDX43与TRIF或IPS-1共沉淀,存在相互作用。这表明在尼罗罗非鱼中,OnDDX43与TRIF或IPS-1结合参与免疫应答反应。以上结果为阐明尼罗罗非鱼免疫调控机制提供了基础资料。