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论文一 GDF5基因突变对间充质细胞向成软骨细胞分化的影响及其作用机制的研究
生长分化因子5(growth/differentiation factor5,GDF5)又称软骨来源形成蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein1,CDMP1),是骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein,BMP)家族成员之一,GDF5基因定位于20q11.2,全长488kb,编码501个氨基酸,由位于N端的信号肽、中间的前体肽以及C端的成熟肽三部分构成,GDF5前体单肽链合成后,形成同源或异源二聚体,在蛋白水解酶的作用下于RRKRR位点裂解产生成熟肽,分泌到细胞外发挥功能。成熟的GDF5与BMP家族其他成员一样,需要与细胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型BMP受体(bonemorphogenetic protein receptor,BMPR)结合,GDF5主要与BMPRⅠ0B结合,然后活化细胞内的SMAD信号传导途径,调控相关转录因子(如SOX9、ID1和RUNX2等)的表达,进而调控骨和软骨的发育。
GDF5主要在肢芽和未来关节形成部位聚集的间充质细胞中表达,促进软骨前体间充质细胞的聚集,调控其向软骨细胞的分化及成熟,是软骨和骨骼形成的重要调节因子。GDF5突变会导致某些与骨骼发育相关的遗传疾病的发生,近端指(趾)关节粘连(Symphalangism,SYMl)就是其中之一。SYM1是一种罕见的常染色体显性遗传病,病变一般累及近节指骨和中指骨,表现为近节指骨变长,中指骨变短,关节腔狭窄,其功能障碍主要包括近节指(趾)骨关节不能曲伸或曲伸受限,常累及第3、4、5指(趾),还可伴有耳聋、视力异常等其他症状,主要由NOG基因或GDF5基因突变引起。迄今为止文献报道的引起SYM1的GDF5突变共五种:R438L、E491K、N445K/T和L373R,其中L373R为本课题组报道的突变,该突变位点位于GDF5前结构域,Western Blot检测证实该突变不影响成熟GDF5的分泌。为了进一步阐明GDF5 L373R突变体导致SYM1的致病机制,我们构建了相应的真核表达载体,将野生型和突变型GDF5的真核表达载体转染具有间充质干细胞特性的人脐带血管周围细胞(human umbilical cord perivascular cell,HUCPV细胞)和小鼠成肌细胞系C2C12,诱导向成软骨细胞方向分化,通过分析野生型和突变型GDF5对SOX9、ID1等与骨和软骨分化相关转录因子及Ⅱ型胶原(软骨细胞特异标志分子)表达的差异,探讨突变型GDF5对间充质细胞向成软骨细胞分化的影响,进而阐明其导致肢端疾病的致病机制。
材料方法:
1、HUCPV细胞原代培养及表型鉴定
(1)细胞原代培养
脐带离体后剥离Whartons胶,Ⅰ型胶原酶消化18~24h后,收集细胞,接种于培养瓶中,用84%a-MEM+15%胎牛血清+1%抗生素培养基常规培养。细胞达到80~90%汇合度时,胰蛋白酶消化进行传代培养。
(2)表型鉴定
应用免疫组化检测CD34、CD45和CD44分子的表达情况。
2、GDF5诱导HUCPV细胞向成软骨细胞方向分化的研究
(1)实时定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA的表达。
(2)免疫组化和Western Blot检测Ⅱ型胶原的表达。
(3)阿新蓝染色检测聚集蛋白聚糖的表达。
3、GDF5 L373R突变体对间充质细胞向成软骨细胞分化作用机制的研究
(1)构建突变型GDF5 L373R真核表达载体,并通过酶切和测序验证编码序列的正确性。
(2)RT-PCR检测细胞内源性BMP受体的表达。
(3)将野生型和突变型GDF5真核表达载体转染HUCPV细胞和C2C12细胞,并诱导其向成软骨细胞方向分化。
(4)实时定量RT-PCR技术检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原及SOX9、ID1、ID2、ID3、RUNX2和MSX2 mRNA水平的表达。
(5)WesternBlot检测p-SMAD1/5/8、ID1、SOX9蛋白和Ⅱ型胶原的表达。
(6)免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达;阿新蓝染色检测聚集蛋白聚糖的表达;茜素红染色检测钙盐的沉积。
结果:
1、HUCPV细胞的形态观察和表型鉴定
(1)形态学观察
原代培养细胞接种24~48h,倒置显微镜下即有少量体积较大的单核细胞贴壁,散在分布。培养4~8天,贴壁细胞主要为梭形成纤维样细胞,形态相对均一。传代至第3代后细胞呈短梭形排列,形态均一。
(2)表型鉴定
免疫组化结果表明造血干细胞表面标记分子CD34(一)和CD45(一),间充质细胞表面标记分子CD44(+),表明获得的细胞为间充质细胞。
2、GDF5能够促进HUCPV细胞向成软骨细胞方向分化
(1)形态学改变
进行体外分化培养后,HUCPV细胞逐渐由梭型向多角形、多边形改变,中心细胞排列紧密,其中GDF5组细胞改变更为明显。
(2)RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达
单纯条件培养组细胞在第3天已有少量Ⅱ型胶原mRNA的表达,且随培养时间的延长表达量逐渐升高;条件培养5天,GDF5组的细胞Ⅱ型胶原表达较空载体组和单纯条件培养组的细胞明显增高。
(3)免疫组化检测Ⅱ型胶原表达
单纯条件培养组Ⅱ型胶原阳性细胞率为26.6±4.9%;空载体组为28.3±5.5%,GDF5组为48.6±6.2%,GDF5组明显高于单纯条件培养组和空载体组(P<0.05);Western Blot结果显示GDF5组Ⅱ型胶原表达明显高于其他两组。
(4)阿新蓝染色检测聚集蛋白聚糖的表达
单纯条件培养组和空载体组聚集蛋白聚糖染色呈弱阳性,GDF5组染色呈强阳性。
3、GDF5 L373R突变体对间充质细胞向成软骨细胞分化能力的影响
(1)pcDNA3.1-GDF5L373R载体的构建
定点诱变pcDNA3.1-GDF5产生pcDNA3.1-GDF5L373R,序列正确。
(2)RT-PCR检测细胞内源性BMP受体mRNA的表达
HUCPV细胞和C2C12细胞能够表达与GDF5信号传递相关的膜受体(BMPRⅠ A、BMPRⅠ B、BMPRⅡ和ACTRⅡ),在C2C12细胞中BMPRⅠ B的表达量非常低,说明HUCPV细胞存在GDF5信号传导所需的受体,C2C12细胞是BMPRⅠ B缺乏的细胞。
(3)GDF5 L373R突变体对p-SMAD1/5/8表达的影响
在HUCPV细胞和C2C12细胞中,与转染野生型GDF5的细胞比较,转染突变型GDF5的细胞p-SMAD1/5/8表达增加。
(4)GDF5 L373R突变体对软骨分化相关转录因子表达的影响
与转染野生型GDF5的细胞相比较,转染突变型GDF5的HUCPV细胞SOX9表达降低,ID1、RUNX2和MSX2表达增高;转染突变型GDF5的C2C12细胞Sox9表达无明显变化,Id1、Runx2、Id2和Id3表达增加;Western Blot结果显示SOX9和ID1的表达与实时定量RT-PCR结果吻合。
(5)GDF5 L373R突变体对软骨基质成分表达的影响
与转染野生型GDF5的细胞相比较,转染突变型GDF5的HUCPV细胞COL2A1和COL10A1表达降低;转染突变型GDF5的C2C12细胞C012a1和Co110a1表达无明显变化。Western Blot检测Ⅱ型胶原的表达发现转染突变型GDF5的HUCPV细胞Ⅱ型胶原表达较转染野生型GDF5的细胞低;在C2C12细胞中Ⅱ型胶原表达二者无明显差异。免疫组化的结果与Western Blot相似。阿新蓝染色显示聚集蛋白聚糖在转染突变型GDF5的HUCPV细胞中为弱阳性,与Ⅱ型胶原表达趋势相似:茜素红染色显示在转染突变型GDF5的HUCPV细胞中有少量细胞团被染成红色,提示有钙盐沉积,在转染野生型GDF5的细胞中未见明显红色细胞团。
结论:
1、GDF5能够促进HUCPV细胞向成软骨细胞方向分化。
2、在间充质细胞聚集过程中,GDF5 L373R突变体通过改变细胞内SMAD1/5/8磷酸化水平,改变了与间充质细胞向成软骨细胞及成骨细胞方向分化相关的转录因子的表达水平,使其促进向成软骨细胞分化的能力相对减弱,而使向成骨细胞分化的能力相对增强,促进软骨内成骨,导致SYM1的表型。
论文二UBE2B基因多态性与中国东北地区特发性男性不育相关性的研究
全世界育龄夫妇中约有10~15%的人被不孕不育所困扰,其中男性不育因素约占50%,除了涉及解剖、感染、遗传、免疫和内分泌等这些可以解释的原因外还有约40~50%的患者原因不明,临床上称为特发性男性不育症。特发性男性不育症以生精障碍即精液异常最为常见,包括无精子、少精子、精子活动力弱和精子畸形。目前利用基因多态性尤其是单核苷酸多态性(single nueleotidepolymorphisms,SNPs)进行男性不育易感基因的筛选工作已经有一定进展。越来越多的研究表明,一些与精子发生相关基因的SNPs与男性不育可能存在关联性。UBE2B蛋白(泛素结合酶)是泛素途径的关键蛋白,主要作用是转移活化后的泛素,使之与其底物结合。研究表明Ube2b基因敲除后小鼠精子头部形态异常,鞭毛粗细不均,精子的活力降低,导致雄性小鼠不育,因此,Ube2b在哺乳动物正常的生精过程中起着很重要的作用。2008年Suryavathi报道UBE2B基因多态性与印度男性不育密切相关。本文利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)对UBE2B基因3个SNP的基因型进行检测,并对基因型频率、等位基因频率及单体型频率进行统计学分析,以确定UBE2B基因多态性与东北地区男性特发性不育的相关性。
材料方法:
1、研究对象
符合入选要求的男性不育患者外周血样本388例,健康已育男性血液样本312例。根据精液常规检测将病例组分为少弱精症、重度少弱精症和无精症三组。
2、研究方法
(1)血液基因组DNA提取。
(2)常规PCR扩增包含相应SNP位点的基因片段。
(3)相应的限制性内切酶酶切。
(4)8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因型分析。
(5)采用SPSS13.0统计软件包,分别对各病例组与对照组进行基因型、等位基因频率及单体型进行卡方检验分析,P<0.05具有统计学意义。
结果:
1、Hardy-Weinberg平衡检测
采用SPSS13.0统计软件分析UBE2B基因g.-293T>G和g.20016A>G位点在所有研究对象中等位基因频率和基因型频率,结果显示P>0.05说明群体符合Hardy-Weinberg平衡。
2、UBE2B g.-293T>G位点基因型和等位基因频率分析
病例组和对照组TG+GG基因型的频率为8.2%和11.8%,无统计学差异;3个亚组与对照组比较TG+GG基因型的频率无明显差异。病例组和对照组比较,T和G等位基因频率无统计学差异。
3、UBE2B g.20016A>G位点基因型和等位基因频率分析
病例组和对照组AG+GG基因型的频率为16.5%和14.4%,无统计学差异;3个亚组与对照组比较AG+GG基因型的频率无明显差异。病例组和对照组比较,A和G等位基因频率无统计学差异,但是在正常人群中未发现GG纯合基因型,只在无精症患者中检出2例。
4、UBE2B g.9157A>G位点基因型和等位基因频率分析
在病例组和对照组中均未检测到g.9157A>G的碱基互换,基因型均为AA型,没有含G的基因型。
5、单体型分析
病例组和对照组比较,g.-293T>G和g.20016A>G的TA、TG和GG单体型均无明显差异,只有GA型在正常人群中明显增高(P=0.003)。3个亚组(少弱精症、重度少弱精症和无精症)分别与正常对照组进行比较,单体型TA、TG和GG也无明显差异,无精症和少精症中GA型的比例低于正常组(P=0.007和P=0.04)。
结论:
1、UBE2B基因g.-293T>G、g.20016A>G和g.9157A>G与中国东北人群男性不育的发生无明显相关。
2、UBE2B基因g.-293T>G和g.20016A>G的GA单体型可能对男性生育能力有保护作用。