论文部分内容阅读
紧密连接（Tight junctions,TJs）蛋白CLDNs在结直肠癌等多种上皮源性的恶性肿瘤中表达异常,并通过不同的分子机制影响肿瘤的增殖能力。作为紧密连接蛋白CLDNs家族成员之一,Claudin-6（CLDN6）包含一个氨基末端、一个羧基末端和两个胞外环结构。CLDN6羧基末端的PDZ结合基序可与含PDZ结构域的信号蛋白（如ZO-1等）结合,参与信号传递过程,从而在肿瘤细胞增殖的调控中发挥重要作用。本课题组前期工作发现,CLDN6在结直肠癌细胞中低表达;过表达CLDN6显著抑制结直肠癌细胞的增殖。此外,在乳腺癌细胞MCF-7中,CLDN6上调p53的表达介导化疗耐药。同时,预实验结果表明,在结直肠癌细胞中,CLDN6上调p53的表达。由此我们推测,CLDN6抑制结直肠癌细胞的增殖与上调p53的表达有关。p53是一种抑癌基因,当细胞受到电离辐射、致癌剂及突变剂等刺激时,p53蛋白与DNA结合,发挥转录因子的作用,通过激活下游靶基因p21的转录,阻滞细胞周期和修复DNA,若修复失败则诱导细胞凋亡。然而,p53突变或缺失的细胞中,由于无法修复DNA,细胞异常增殖,发展为恶性肿瘤。p53是一种短寿命蛋白质,机体内有很多因子调控p53蛋白的稳定性,其中MDM2是p53基因的主要负调控因子。MDM2调节p53的多种功能,包括直接阻断p53氨基末端的转录活化域,促进p53从细胞核转向细胞质,并介导p53的泛素化降解。MDM2是Akt信号通路的下游靶基因。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可以特异性结合底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基。Akt氨基末端的PH结构域可以与磷脂酰肌醇3磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3）结合,使Akt从细胞质转移到细胞膜上并发生磷酸化,从而激活Akt信号通路。PTEN是一种具有磷酸酶活性的抑癌基因,使其底物PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2,进而抑制Akt信号通路的激活。PTEN的羧基末端具有PDZ结合基序。因此,我们推测,CLDN6可以通过PDZ结构域和PTEN结合。由此,我们推测CLDN6通过PTEN/Akt信号通路调控p53进而抑制结直肠癌细胞的增殖。目的探讨CLDN6通过PTEN/Akt信号通路调控p53对结直肠癌细胞增殖的抑制作用,为CLDN6在结直肠癌增殖中的机制研究提供理论支持与实验依据。方法1.CLDN6在结直肠癌中的表达利用GEO数据库分析结直肠癌患者中CLDN6的表达,其中GSE44076数据集中包含98例成对的结直肠癌及癌旁组织,GDS4515数据集中包含34例结直肠癌组织和15例癌旁组织;RT-PCR和Western-Blot技术检测结直肠癌细胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中CLDN6的表达。2.CLDN6对结直肠癌细胞增殖能力的影响（1）构建过表达CLDN6的稳转细胞株:使用293T细胞包装过表达CLDN6的慢病毒,通过慢病毒感染细胞建立过表达CLDN6的HCT116 p53+/+和HCT116p53-/-细胞株;通过RT-PCR、Western-Blot和免疫荧光实验鉴定转染细胞株中CLDN6的表达和亚细胞定位。（2）CLDN6对增殖能力的影响:CCK8和克隆形成法检测过表达CLDN6对HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞增殖能力的影响。3.CLDN6调控p53对结直肠癌细胞增殖的作用机制以稳定过表达CLDN6的HCT116 p53+/+细胞为研究对象,探讨CLDN6调控p53抑制细胞增殖的作用机制。（1）CLDN6对p53的调控作用:RT-PCR和Western-Blot技术检测p53的表达;细胞免疫荧光和Western-Blot技术检测p53的亚细胞定位;细胞培养时加入放线菌酮（CHX）,Western-Blot技术检测p53的半衰期。（2）CLDN6通过PTEN/Akt调控p53的表达:Western-Blot技术检测ZO-1和PTEN的表达;免疫共沉淀法检测过表达CLDN6组中ZO-1和PTEN的结合情况;Western-Blot技术检测PTEN、Akt和MDM2的表达;细胞培养时加入PTEN抑制剂VO-Ohpic,Western-Blot技术检测PTEN、Akt和p53的表达。结果1.CLDN6在结直肠癌中低表达GEO数据库分析结果显示,与癌旁组织相比,CLDN6在结直肠癌组织中低表达（P<0.01）。RT-PCR和Western-Blot结果显示,HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞中CLDN6表达显著低于阳性对照细胞(HCT116 p53+/+细胞PmRNA<0.05,P蛋白<0.01;HCT116 p53-/-细胞PmRNA<0.05,P蛋白<0.05)。以上结果表明,在结直肠癌中CLDN6低表达。2.CLDN6依赖p53抑制结直肠癌的增殖能力（1）鉴定过表达CLDN6的稳转细胞株:RT-PCR和Western-Blot的结果显示,过表达CLDN6组中CLDN6在RNA和蛋白水平的表达均明显高于空载组(HCT116 p53+/+细胞PmRNA<0.001,P蛋白<0.05;HCT116 p53-/-细胞PmRNA<0.01,P蛋白<0.05);细胞免疫荧光结果显示,CLDN6主要分布于细胞膜和细胞质中。结果表明,成功构建了过表达CLDN6的细胞株。（2）CLDN6对结直肠癌细胞增殖的影响:CCK8结果显示,过表达CLDN6的HCT116 p53+/+细胞活力降低（P<0.05）;克隆形成实验结果显示,过表达CLDN6的HCT116 p53+/+细胞的克隆形成数量低于空载组（P<0.05）。但CLDN6对HCT116 p53-/-细胞的增殖和集落形成能力无明显影响。结果说明,CLDN6抑制结直肠癌细胞的增殖与p53有关。3.CLDN6调控p53抑制结直肠癌细胞增殖的机制（1）CLDN6对p53的调控作用:RT-PCR和Western-Blot结果显示,过表达CLDN6组p53蛋白表达明显增加（P<0.05）,mRNA无明显变化;细胞免疫荧光和Western-Blot结果显示,与空载组相比,过表达CLDN6组核内的p53表达增多（P<0.05）;Western-Blot结果显示,CHX处理细胞后过表达CLDN6组p53的半衰期明显延长（P<0.05）。（2）CLDN6通过PTEN/Akt调控p53的表达:免疫共沉淀结果显示,细胞中ZO-1蛋白和PTEN蛋白存在结合,Western-Blot结果显示,过表达CLDN6组中PTEN的表达明显高于空载组（P<0.001）,磷酸化Akt及MDM2的表达低于空载组(PAkt<0.01,PMDM2<0.001);PTEN抑制剂逆转CLDN6对p53的调控。结论（1）CLDN6在结直肠癌中低表达（2）CLDN6依赖p53抑制结直肠癌细胞的增殖（3）CLDN6通过PTEN/Akt通路调控p53的表达